ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 35900.2—2018 动物流感检测 第2部分：H3亚型流感 病毒核酸荧光RT-PCR检测方法 Animal influenza detectionPart 2: Method of real-time RT-PCR for the detection of H3 subtype influenza virus 2018-09-01实施 2018-02-06发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T35900.2-—2018 前言 GB/T35900《动物流感检测》目前分为3个部分： 第1部分：H1亚型流感病毒核酸荧光RT-PCR检测方法； 一第2部分：H3亚型流感病毒核酸荧光RT-PCR检测方法； 一第3部分：H1和H3亚型流感病毒核酸双重荧光RT-PCR检测方法。 本部分为GB/T35900的第2部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本部分由中华人民共和国农业部提出。 本部分由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本部分起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局 本部分主要起草人：刘环、乔彩霞、蒲静、张伟、高志强、谷强、张鹤晓、张利峰、韩晶 1 GB/T35900.2—2018 引 言 本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到本文件4.1.8与“检测H1和H3亚型 流感病毒的核苷酸序列和试剂盒”相关的专利的使用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场 该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意向任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下， 就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下 联系方式获得： 专利持有人：中华人民共和国北京出入境检验检疫局 地址：北京市朝阳区甜水园街6号。 请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专 利的责任。 I GB/T 35900.2—2018 动物流感检测第2部分：H3亚型流感 病毒核酸荧光RT-PCR检测方法 1范围 GB/T35900的本部分规定了H3亚型流感病毒核酸的荧光RT-PCR操作方法。 本部分适用于禽、猪和马及其产品中H3亚型流感病毒核酸的检测， 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19438.1—2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 荧光RT-PCR R实时荧光反转录聚合酶链反应（real-timereversetranscriptpolymerasechainre- action) Ct(或 Cp）值 每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数（cyclethreshold，or crossing point) cRNA 互补RNA(complementRNA) DEPC 焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate） FAM 羧基荧光素（carboxyfluorescein） MGB 小沟结合物（minorgroovebinder） PBS 磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersaline) RNA 核糖核酸（ribonucleicacid) 4 试剂和材料 4.1试剂 4.1.1 总则：除非另有说明，所用试剂均为分析纯，所用液体试剂均需使用无RNA酶的容器进行分装 4.1.2 TRIzol:2℃~25℃保存。 4.1.3氯仿：2℃~8℃预冷。 4.1.4异丙醇：一20℃预冷。 4.1.5DEPC水：见附录A中A.1。 4.1.6 75%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，一20℃预冷。 1 GB/T35900.2—2018 4.1.7PBS（含牛血清白蛋白、青霉素和链霉素）：配方见A.2。 4.1.8引物和探针序列及反应液配方：见附录B。 4.1.9阳性对照为灭活的H3亚型动物流感病毒或体外转录的H3亚型流感病毒HA基因cRNA溶 液；阴性对照为已知流感病毒阴性的禽、猪或马组织悬液。 4.2 仪器设备及耗材 4.2.1 荧光PCR检测仪及配套反应管（板）。 4.2.2 高速台式冷冻离心机（最高离心速度不低于12000r/min）。 4.2.3 台式离心机。 4.2.4振荡器。 4.2.5 组织匀浆器。 4.2.6 冰箱（2℃8℃和-20℃两种）。 4.2.7 微量移液器（5μL、10μL、100μL、1000μL）及配套吸头（无核酸酶）。 4.2.8 1.5mL离心管（无核酸酶）和5mL采样管。 5实验室的标准化设置与生物安全管理 本方法的实验室设置与管理见GB/T19438.1—2004附录C；实验室生物安全管理见GB19489。 6样品的采集与前处理 6.1总则 采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中应戴一次性手套。 6.2 2采样及处理工具 6.2.1采样专用商品化棉拭子、剪刀、镊子、研钵、5mL采样管、一次性采样袋。 6.2.2除棉拭子和采样袋外，上述取样工具应经121℃土2℃，15min高压灭菌并烘干或经160℃干烤 2 h。 6.3样品采集 6.3.1拭子样品 活动物采集拭子样品。根据动物种类可采集咽喉拭子、泄殖腔拭子（禽类）或鼻拭子（猪、马等其他 动物）。采集方法如下： 一取咽喉子时将拭子深人喉头及上颚裂来回刮2次～3次并旋转，取分泌液； -取泄殖腔拭子时将拭子深人泄殖腔旋转一圈并沾取少量粪便； 取鼻拭子时将子深人鼻腔来回刮2次～3次并旋转，取分泌物 将采样后的子放入盛有2.0mLPBS（含牛血清白蛋白、青霉素和链霉素）的采样管中，编号。 6.3.2组织样品 病死动物采集肺脏或气管等组织。用无菌剪、镊采集待检组织，装人一次性采样袋或其他灭菌容 器，编号。 2 GB/T35900.2—2018 6.4样品购运 样品采集后置保温箱中，加人预冷的冰袋，密封，24h内送实验室。 6.5样品处理 6.5.1拭子样品 样品在振荡器上充分混合后，将拭子中的液体挤出，3000r/min离心5min，吸取上清液1.0mL转 人无菌的1.5mL离心管中，编号备用。 6.5.2组织样品 用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品2.0g于研钵或组织匀浆器中充分研磨，再加10.0mLPBS（含 牛血清白蛋白、青霉素和链霉素）混勺，3000r/min离心5min后，取1.0mL上清液转人无菌1.5mL 灭菌离心管中，编号备用。 6.6样品存放 采集或处理好的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置一70℃冰箱， 但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。 7操作方法 7.1样品核酸提取 7.1.1在样本制备区进行，采取TRIzol裂解法提取；也可采用其他等效的RNA提取方法 7.1.2待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示，取n个灭菌1.5mL离心管，逐管编号。 7.1.3每管加人 600 μL TRIzol。 7.1.44 7.1.5每管加入200μL氯仿，充分颠倒混匀。于4℃、12000r/min离心15min。 7.1.6新取n个灭菌的1.5mL离心管，逐管编号，每管加人500μL异丙醇（-20℃预冷）。 混匀。 7.1.8于4℃、12000r/min离心15min，轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沥干液体，不同样品应在吸 水纸不同地方沥干。 7.1.9每管加人600μL75%乙醇（一20℃预冷），颠倒洗涤。 吸水纸不同地方沥干。 7.1.114000r/min离心10s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量移液器尽量将其吸干。注意一 份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面。 7.1.12室温干燥3min。不宜过于干燥，以免RNA不溶。 7.1.13每管加入11uLDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，获得RNA溶 液，冰浴保存备用（4℃保存不超过8h，若需长期保存应放置一70℃冰箱）。 7.2扩增试剂的准备与配制 7.2.1在反应混合物配制区进行。 3 GB/T35900.2—2018 7.2.2每个检测反应体系需使用15μL荧光RT-PCR反应液。根据7.1.2中设定的n值，按表B.2配 制反应液，充分混匀后分装，每个反应管15uL。转移反应管至样本制备区。 7.3加样 7.3.1在样本制备区进行。 7.3.2在上述7.2.2的反应管中分别加人7.1.13中制备的RNA溶液10μL，使每管总体积达到25μL， 记录反应管对应的样品编号。盖紧管盖后，瞬时离心。 7.4荧光RT-PCR反应 7.4.1在检测区进行。 7.4.2将7.3.2加样后的反应管放入荧光PCR检测仪内，记录反应管摆放顺序。选定FAM作为报告 基团，MGB作为淬灭基团，反应参数设置如下： 第一阶段，反转录42℃/30min； 第二阶段，预变性94℃/3min； 第三阶段，94℃/15s，50℃/10s，60℃/35s，40个循环，在第三阶段每次循环的60℃退火延 伸时收集荧光。试验结束后，根据收集的荧光曲线和Ct（或Cp）值判定结果。 8结果判定 8.1 结果分析条件设定 阅值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点 为准。 8.2 实验成立的条件