T/ZNZ 浙 江 省 农 产 品 质 量 安 全 学 会 团 体 标 准 T /ZNZ 029—2020 水产品中喹诺酮类药物残留的快速检测 胶体金免疫层析法 Rapid detection of quinolones residues in aquatic products -Colloidal gold immunochromatographic method 2020-09-15发布 2020-10-15实施 浙江省农产品质量安全学会 发布 ICS 65.060.99 B 90 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 029-2020 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020给出的规则起草。 本文件由浙江省农产品质量安全学会 提出并归口。 本文件起草单位：浙江省水产技术推广总站、杭州市农业科学研究院、 杭州南开日新生物技术有限 公司、北京六角体科技发展有限公司 。 本文件主要起草人 :王扬、柯庆青、柳爱春、桑丽雅、贝亦江、何欣、王鼎南、周钦、孔俏丹、丁 雪燕。 本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 029-2020 1 水产品中喹诺酮类药物残留的快速检测 胶体金免疫层 析法 1 范围 本文件规定了水 产品中喹诺酮类药物残留的免疫胶体金快速筛查检测方法。 本文件适用于鱼、虾、蟹、龟鳖、贝类等水产品肌肉等可食部分中喹诺酮类药物残留的快速筛查检 测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 30891 -2014 水产品抽样规范 农业部1077号公告-1-2008 水产品中17种磺胺类及 15种喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱 -串 联质谱法 3 术语及定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 本方法应用竞争抑制免疫层析原理。试样中喹诺酮类药物，经有机试剂提取、净化、吹干、复溶后 后滴加在喹诺酮类免疫胶体金快速检测试剂条加样孔中， 样品中喹诺酮类药物与胶体金标记的特异性单 克隆抗体结合，未被喹诺酮类药物结合的抗体与检测线 （T线）上的抗原反应显色，已与喹诺酮类药物 结合的金标抗体则不能与检测线上的抗原结合，通过 T线后，与控制线（ C线）上的二抗反应显色。用胶 体金读卡仪或目测比较板上控制 线（C线）和检测线（ T线）上红色条带的有无及颜色相对深浅， 对样品 中喹诺酮类药物 含量进行定性判定。 图1 免疫胶体金 快速检测试剂条测定示意图 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 029-2020 2 5 试剂和材料 5.1 乙腈（ C2H3N） 5.2 正己烷（C6H14） 5.3 PBST缓冲液：溶解 8.0 g氯化钠、 0.2 g氯化钾、 1.44 g磷酸氢二钠 (Na 2HPO 4·12H 2O)、0.24 g磷 酸二氢钾、 0.5 mL吐温 -20于800 mL水中，加水溶解并定容至 1000 mL，经 121℃灭菌 15 min。 5.4 喹诺酮类药物 标准物质， 中文名称、英文名称、 CAS登录号、分子式、相对 分子量见表 1，各组 分纯度≥ 99%。 表1 喹诺酮类参考物质的中文名称、英文名称、 CAS登录号、分子式、相对分子量 序号 中文名称 英文名称 CAS登录号 分子式 相对分子量 1 洛美沙星 Lomefloxacin 98079 -51-7 C17H19F2N3O3 351.35 2 培氟沙星 Pefloxacin 70458 -92-3 C17H20FN 3O3 333.36 3 氧氟沙星 Ofloxacin 82419 -36-1 C18H20FN 3O4 361.37 4 诺氟沙星 Norfloxacin 70458-96-7 C16H18FN 3O3 319.33 5 恩诺沙星 Enrofloxacin 93106 -60-6 C19H22FN 3O3 359.16 6 环丙沙星 Ciprofloxacin 85721 -33-1 C17H18FN 3O3 331.13 注1：或等同可溯源物质。 5.5 喹诺酮类药物混 合标准物质 标准溶液：分别 精确称取洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、 恩诺沙星、环丙沙星标准物质 (5.4)各0.010g，加入甲酸 2.0mL，用甲醇溶解， 定容到 100mL，配成 100 μg/mL的标准混合储备溶液，于 -18℃保存，有效期 12个月；移取适量标准储备溶液，用甲醇稀释成 20ng/mL 中间浓度标准液，于 4℃保存，有效期 3个月；使用时，用甲醇稀释中间浓度标准液，配成适 当浓度的标准使用溶液，现配先用。 5.6 喹诺酮类药物 免疫胶体金 快速检测 试剂条： 密封包装，干燥阴凉处保存，用前恢复至室温（ 20℃ ±5℃） ，即开即用。若试剂 条需要验证时，具体 方法和性能指标见附录 A。本方法所述试剂、试剂盒信 息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。 5.7 除特殊注明外，本法所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 规定的二级 水。 6 仪器和设备 6.1 电子天平：感量 0.01 g和0.001 g。 6.2 均质机：转 速≥8000 r/min 。 6.3 离心机：转速 ≥4 000 r/min 。 6.4 氮气或空气吹干仪：加热温度 ≥75 ℃。 6.5 微量移液器： 10 μL～100 μL，100 μL～1 000μL。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 029-2020 3 6.6 高压灭菌锅。 6.7 胶体金读卡仪（必要时） 7 测定步骤 7.1 抽样 按照GB/T 30891 要求进行抽样，参考 附录表B.1填写采样 信息记录。 7.2 试样制备 按照GB/T 30891 -2014附录B规定进行各类水产品制样，将样品分割 成不大于0.5 cm ×0.5 cm ×0.5 cm 的小块后混合，用均质 后制成试样。将试样分成检样和备样两份，并做标记，每份不少于 20g；检样立 即测试或 -18℃以下冷冻待测，备样 -18℃以下冷冻保藏，有效期不超过 3个月。 7.3 提取和净化 称取2.00 g均质后的样品 于5mL离心管中，加入 3mL乙腈（5.1），剧烈振荡 3min，室温下，于 4 000r/min离心5min；移取2 mL上清液于 5 mL离心管中 ，在75℃下用氮气或空气吹干 ；依次加入 0.3mL 正己烷（ 5.2）和0.3mL PBST缓冲液（ 5.3），加盖，上下缓慢颠倒 20次；静置分层 后，吸取下层溶液 待测。 7.4 测定 喹诺酮类药物 免疫胶体金 快速检测试剂条 （5.5），恢复室温后，从包装袋中取出， 置于水平台面 上。吸取 7.3中待测液的下层溶液 100 μL，加至喹诺酮类药物 免疫胶体金快速检测 试剂条的加样孔中， 在3 min～5 min内读取检测结果。 7.5 质控试验 每批样品应同时进行空白试验和 阴性、阳性对照 质控试验。 7.5.1空白试验 每批样品需做一孔空白对照，以 PBST缓冲液（5.3）代替试样提取液，按 7.4进行。 7.5.2 阴性对照 称取空白样品，按 7.3和7.4进行。 7.5.3 阳性对照 在空白样品加入一定量喹诺酮类药物混合标准溶液（其含量≥检测限），按 7.3和7.4进行。 8 结果判断 及表述 8.1 试剂条有效性判定 8.1.1 有效检测 试剂条：空白对照控制线（ C线）和检测线（ T线）均出现红色条带，而且 T线颜色 达到或深于C线（如图 2-1），则检测 试剂条有效，可进行检测 ； 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 029-2020 4 8.1.2 失效检测 试剂条：空白对照控制线（ C线）不出现红色条带（如图 2-3），则检测 试剂条失效， 不能进行检测 。 8.2 结果和表述 8.2.1阴性 试样检测线（ T线）出现红色条带，且颜色达到或深于控制线 （C线）（如图 2-1）为阴性。结果 表述：阴性（ 喹诺酮类药物 残留量 <检测限）。 8.2.2阳性 试样检测线（ T线）出现红色条带，但颜色 浅于控制线（ C线）或检测线（ T线）未出现红色条带 （如图 2-2），为阳性。结果表述：阳性（ 喹诺酮类药物 残留量≥检测限 ）。 图2-1 图2-2 图2-3 8.3 试剂条验证 试剂条性能验证参照附录 A.1执行。 8.4 试验质控要求 操作人员需经过专业培训，具备一定的相关工作经验。宜选用按 8.3进行验证，结果符合附录 A.2 中各项性能指标的试剂条，按照说明书要求规范操作。 同检测批不低于 20%比例的平行样和 2个阴性控制 样品测定，同时加做 2个的阳性质控样 (5倍检测限和检测限 各一个)，进行阴性和阳性对照 质控试验 ；当 平行样的检测结果完全一