ICS 65.120 B46 团 体 标 准 T/NAIA 002—2020 发酵饲料中乳酸含量的测定 高效液相色谱法 Determination of lactic acid content in fermented feeds High performance liquid chromatography 2020-07-07 发布 2020-08-01 实施 宁夏化学分析测试协会 发 布 全国团体标准信息平台 1前 言 本标准的编写格式符合 GB/T 1.1-2009 《标准化工作导则 第 1 部分 标准的结构和编写》规 定编写。 本标准由宁夏化学分析测试协会提出并归口。 本标准由宁夏大学、宁夏饲料工程技术研究中心、宁夏兽药饲料监察所、宁夏饲料工作站、 宁夏农林科学院、宁夏昊标检测服务研究院、宁夏化学分析测试协会起草。 本标准主要起草人：辛国省、刘辉、卜姣姣、燕翀、杨仪、丁园、高巧仙、王建林、武晓 宏、谢荣国、张小飞、张艳、王京、杨洁。 本标准为首次发布。 全国团体标准信息平台 2发酵饲料中乳酸含量的测定 高效液相色谱法 1　范围 本标准规定了发酵饲料中乳酸含量高效液相色谱法。 本标准适用于发酵饲料中乳酸含量的测定。 本方法定量限： 800mg/kg 。 2　规范性引用文件 下列文件中的条款通过在本标准中的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其 随后所有的修改单 (不包括勘误的内容 )或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于 本标准。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 601 化学试剂 标准滴定溶液的制备 GB/T 14699.1 饲料 采样 3　原理 利用乳酸易溶于水的特点，乳酸加水超声提取后，稀释至适当的浓度，试液过滤膜进高效液 相色谱仪经 C18色谱柱分离，在 210nm 波长下紫外检测器检测，外标法计算乳酸的含量。 4　试剂与材料 除另有说明外，所用试剂均为优级纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。 4.1　乙腈（色谱纯）。 4.2　磷酸（色谱纯）。 4.3　0.1%磷酸溶液：准确吸取 1.0mL 磷酸（4.2）溶于水中，定容至 1000mL。 4.4　氢氧化钠。 4.5　0.1mol/L 氢氧化钠标准滴定溶液，按 GB/T601 配制和标定。 4.6　酚酞。 4.7　1%酚酞指示剂溶液： 1g 酚酞溶于 60mL95%乙醇中，用水稀释至 100mL。 5　仪器和设备 5.1　分析天平：感量 0.0001 g。 全国团体标准信息平台 35.2　超声波清洗器。 5.3　微孔滤膜：孔径 0.45um。 5.4　容量瓶： 50mL、100mL、1000mL。 5.5　高效液相色谱仪（配有紫外检测器）。 6　试样制备与保存 按GB/T 14699.1规定，取代表性的样品 1kg，四分法缩减取 200g装入磨口瓶中备用。 7　测定步骤 7.1　样品溶液制备 称取试样 1g～5g，置于100mL容量瓶中，加 60mL水，在50℃水浴中超声提取 20min，冷却至室温， 用水定容至刻度，摇匀，过滤。取滤液稀释，使最后稀释液中乳酸的浓度均在工作曲线之内，取部分 稀释液过 0.45μm 滤膜，滤液作为试样溶液。 7.2　高效液相色谱条件 色谱柱： C18 柱，长250mm，内径4.6mm，粒径5μm，或性能相当。 柱温：35℃。 流动相：乙腈 +磷酸溶液 (4.3)＝2.5+97.5( 体积比)。 流速：1.0mL/min 。 检测波长： 210nm。 进样量： 20μL。 7.3　平行试验 对同一试样进行平行试验测定。 7.4　空白试验 随同试样进行空白试验。除不称取样品外，均按试样步骤进行。 7.5　乳酸标准储备溶液的制备和标定 称取乳酸约 3g于500mL圆底烧瓶中，加 270mL水，装上球形冷凝管，接通冷却水，加热回流 15h，冷 却至室温。移取 20mL溶液，加 40mL～60mL水及0.2mL1%酚酞指示剂，用 0.1mol/L 氢氧化钠标准滴定溶 液滴定至微红色 30s不褪色，记录消耗 0.1mol/L 氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数（ V1），乳酸标准储 备溶液置于 4℃冰箱保存，有效期为 3 个月。 乳酸标准储备液的浓度 Cs（μg/mL），按（ 1）计算： 1000 08.90V)V-(VCC 20 1 S   )1( 式中: C-氢氧化钠溶液的浓度，单位为 mol/L； 全国团体标准信息平台 4V1-滴定乳酸溶液所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为 mL； V0-空白试验所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为 mL； V2-移取乳酸溶液的体积，单位为 mL； 90.08-乳酸的摩尔质量。 7.6　测定及曲线绘制 分别取乳酸标准溶液和试样溶液，按照 7.2列出的条件进行液相色谱分析测定。以乳酸含量 (μ g/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。 8　分析结果的计算 按式(2)计算试样中的乳酸含量 X，以质量分数表示 (%)。 10010(%)6mnVCXS)2( 式中： Cs—由标准曲线查得乳酸的浓度，单位 (μg/mL）； V—试样液总体积，单位 (mL）； n—稀释倍数； m—称取试样的质量，单位（ g）。 9　重复性 在重复性条件下，完成两个平行测定的结果的相对偏差不大于 5%。 _________________________________ 全国团体标准信息平台