(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210643259.2 (22)申请日 2022.06.08 (71)申请人 天津医科 大学眼科医院 地址 300384 天津市南 开区复康路251号 (72)发明人 林婷婷　汤勤　孙迪　朱利民　 刘勋　赵今稚　 (74)专利代理 机构 北京瑞盛铭杰知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11617 专利代理师 刘莹 (51)Int.Cl. A61K 47/69(2017.01) A61K 47/62(2017.01) A61K 31/555(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 KC26多肽修饰的牛奶外泌体及其制备方法 和应用 (57)摘要 本发明提出KC26多肽修饰的牛奶外泌体的 制备方法和应用， 属于医药技术领域。 所述制备 方法包括如下步骤： (a)制备牛奶外泌体， 将所得 牛奶外泌体添加至溶剂中， 得牛奶外泌体溶液； (b)将KC2 6多肽添加至超纯水中， 搅拌， 得多肽溶 液； (c)将上述牛奶外泌体溶液添加到上述多肽 溶液中， 反应后， 冻干保存， 得KC26多肽修饰的牛 奶外泌体。 本发明以卡铂为细胞毒药物， 以牛奶 外泌体为载体， 以天冬酰胺内肽酶为靶点， 三者 有机结合， 形成 “药物‑载体‑靶点”模型， 更有利 于提高化疗 药物的生物利用度， 有效降低药物毒 性和不良反应， 具有很好的抑癌效果。 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 115089727 A 2022.09.23 CN 115089727 A 1.一种KC26多肽修饰的牛奶外泌体的制备 方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： (a)制备牛奶外泌体， 将所 得牛奶外泌体添加至溶剂中， 得 牛奶外泌体溶 液； (b)将KC26多肽添加至超纯 水中， 搅拌， 得多肽溶 液； (c)将上述牛奶外泌体溶液添加到上述多肽溶液中， 反应后， 冻干保存， 得KC26多肽修 饰的牛奶外泌体。 2.根据权利要求1所述的制备 方法， 其特 征在于， 步骤(c)中， 所述牛奶外泌体与所述KC26多肽的质量比为1:3 。 3.根据权利要求1所述的制备 方法， 其特 征在于， 步骤(c)中， 所述反应为 4℃反应24小时。 4.根据权利要求1所述的制备 方法， 其特 征在于， 步骤(b)中， 所述KC26多肽与超纯 水的比例为3 6mg： 10mL。 5.根据权利要求1所述的制备 方法， 其特 征在于， 步骤(a)中， 所述牛奶外泌体与溶剂的比例为12mg： 1mL； 所述溶剂为甲醇、 乙醇、 丙醇、 尿素、 甘油、 氢 氧化钠或乙酸中至少一种。 6.根据权利要求1所述的制备 方法， 其特 征在于， 步骤(a)中， 所述牛奶外泌体的制备 方法， 包括如下步骤： (a1)牛奶第一离心后， 去除脂肪球、 酪蛋白和碎片， 得第一溶 液； (a2)将上述第一溶 液第二离心后， 去除大颗粒和微 泡， 得第二溶 液； (a3)将上述第二溶 液第三离心后， 弃 上清液， 洗涤沉淀， 得外泌体沉淀； (a4)将上述外泌体沉淀重新悬浮于磷酸盐缓冲液中， 通过0.22 μm过滤器过滤、 灭菌， 得 牛奶外泌体。 7.根据权利要求6所述的制备 方法， 其特 征在于， 步骤(a1)中， 所述第一离心为 4℃以13000g离心30min； 步骤(a2)中， 所述第二离心为 4℃以10万g离心6 0min； 步骤(a3)中， 所述第三离心为 4℃以135000g离心90min。 8.权利要求1～7任一项所述的制备 方法制备 得到的KC26多肽修饰的牛奶外泌体。 9.权利要求8所述的KC26多肽修饰的牛奶外泌体在制备用于治疗视网膜母细胞瘤药物 中的应用。 10.根据权利要求1所述的应用， 其特 征在于， 将KC26多肽修饰的牛奶外泌体与卡铂混合得用于治疗视网膜母细胞瘤药物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115089727 A 2KC26多肽修饰的牛奶外泌体及其制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明属于医药技术领域， 尤其涉及KC26多肽修饰的牛奶外泌体的制备方法和应 用。 背景技术 [0002]视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma， RB)是儿童最常见的眼内恶性肿瘤， 好发于3岁 以下儿童， 平均发病年龄仅18个月， 约10％～15％的患者可以发生肿瘤转移， 严重危害患儿 的视功能及生命。 我国每年 新增患者约为1 100例， 且84％为眼内期晚期高风险患者。 [0003]治疗技术的进步使RB患者能够在保生命的前提下保存眼球(保眼)和视功能。 治疗 方法主要包括冷冻、 激光光凝、 全身化疗、 眼球摘除术以及通过眼内、 球周和眼动脉介入途 径的局部化疗等， 并且强调多学 科综合治疗。 [0004]目前， 化学治疗(化疗)仍是眼内期RB的一线治疗方法， 其有效抑制RB细胞转移， 同 时减少放射治疗(放疗)的诸多并发症。 根据注药途径分为静脉化疗、 动脉化疗和玻璃体腔 注药化疗。 RB化疗面临两大困境： 一是药物缺乏靶向性， 全身或局部副作用大； 二是药物对 视网膜下腔或玻璃体腔的肿瘤渗透性差， 残存肿瘤细胞成为复发根源。 可见， 临床仍然缺乏 一种积极有效的新型靶向递药系统用于提高化疗药物的生物利用度和安全性。 [0005]靶向药物 递送系统(targeted  drug delivery systems,TDDS)是提高化疗效果的 重要手段之一。 天然细胞来源的外泌体大小约30 ‑150nm， 常被用作肿瘤靶向纳米药物递送 系统的载体。 主要 具有以下特征： 可以逃避 单核吞噬细胞系统的快速清除， 甚至可以穿透血 脑屏障； 磷脂双分子层构成的中空结构使其既可以在膜上装载亲脂性药物， 也可以在内部 包裹亲水性药物； 其生物来源保证了良好的生物相容性、 低免疫原 性和低毒性； 表面呈现负 电为其提供了循环稳定性。 然 而， 天然细胞来源的外泌体生产成本高， 操作复杂。 发明内容 [0006]本发明提出酶敏感的KC26多肽修饰的牛奶外泌体及其制备方法和应用， 根据天冬 酰胺内肽酶可作为肿瘤微环境响应型递药设计及治疗应用靶点的特点， 引入天冬酰胺内肽 酶敏感的KC26多肽修饰牛奶外泌体， 以实现药物靶向作用， 提高化疗药物生物利用率。 [0007]本发明提出一种KC26多肽修饰的牛奶外泌体的制备 方法， 包括如下步骤： [0008](a)制备牛奶外泌体， 将所 得牛奶外泌体添加至溶剂中， 得 牛奶外泌体溶 液； [0009](b)将KC26多肽添加至超纯 水中， 搅拌， 得多肽溶 液； [0010](c)将上述牛奶外泌体溶液添加到上述多肽溶液中， 反应后， 冻干保存， 得KC26多 肽修饰的牛奶外泌体。 [0011]进一步地， 步骤(c)中， 所述牛奶外泌体与所述KC26多肽的质量比为1:3 。 [0012]进一步地， 步骤(c)中， 所述反应为 4℃反应24小时。 [0013]进一步地， 步骤(b)中， 所述KC26多肽与超纯 水的比例为3 6mg： 10mL。 [0014]进一步地， 步骤(a)中， 所述牛奶外泌体与溶剂的比例为12mg： 1mL；说　明　书 1/5 页 3 CN 115089727 A 3