(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210639709.0 (22)申请日 2022.06.08 (71)申请人 华东师范大学 地址 200241 上海市闵行区东川路5 00号 (72)发明人 江文正　张颖　 (74)专利代理 机构 上海麦其知识产权代理事务 所(普通合伙) 31257 专利代理师 董红曼 (51)Int.Cl. C12N 15/12(2006.01) C12N 15/113(2010.01) C12N 15/867(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 5/10(2006.01) A61K 39/00(2006.01)A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种TIGIT基因干扰的嵌合抗原受体NK细胞 及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种TIGIT基因干扰的嵌合抗 原受体NK细胞及其用途。 本发明提出利用RNA干 扰技术敲低TIGIT在NKG2D ‑CAR‑NK细胞中的表 达， 普遍增 强CAR‑NK细胞功能的通用型方法， 提 升NKG2D‑CAR‑NK细胞免疫疗法的效果。 本发明还 公开了一种T IGIT基因RNAi靶序列以及基于 该靶 序列的干扰序列、 及其构建方法和应用。 本发明 可应用于恶 性肿瘤病免疫治疗中， 为利用CAR ‑NK 治疗肿瘤提供新的改良思路， 具有广泛应用前 景。 权利要求书2页 说明书8页 序列表3页 附图2页 CN 114836428 A 2022.08.02 CN 114836428 A 1.一种TIGIT基因RNAi靶序列， 其特 征在于， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.1、 5、 6所示。 2.一种基于如权利要求1所述TIGIT基因RNAi靶序列的干扰序列， 其特征在于， 其序列 如SEQ ID NO.2、 3、 7、 8、 9、 10所示。 3.如权利要求2所述的干扰序列的构建方法， 其特征在于， 所述方法为， 5端以G开头， 设 定G+C含量 为30％～50％； 根据pL L3.7载体的要求， 包括如下步骤： (1)在正义链5’端加T重建U6启动子l 位的T； (2)干扰靶序列后加L oop环“TTCAAGAGA”； (3)加入反转互补序列及终止信号 “TTTTTT”； (4)在3’端再加上E coR I酶切位点GAATTC以方便鉴定； (5)再补平Xho  I酶切位点合成一对互补片段。 4.一种载体， 其特 征在于， 其包 含如权利要求2所述的干扰序列。 5.一种表达载体质粒， 其特征在于， 其为pLL3.7 ‑TIGIT‑shRNA‑NKG2D‑CAR表达载体质 粒。 6.一种表达载体质粒的构建方法， 其特 征在于， 所述方法包括如下步骤： (1)将NKG2D蛋白的胞外段基因序列加入CD8a信号肽的序列， 经过RT ‑PCR方式扩增得到 如SEQ ID NO.4所示的Sig ‑NKG2D胞外段序列； (2)将所述sig ‑NKG2D胞外段序列通过重叠PCR方式连接到二代CAR(4 ‑1B‑CD3ζ )， 获得 pLL3.7‑NKG2D‑CAR载体； (3)将如权利要求2所述的干扰序列连接到所述pLL3.7 ‑NKG2D‑CAR载体上， 得到所述 pLL3.7‑TIGIT‑shRNA‑NKG2D‑CAR表达载体质粒。 7.一种细胞， 其特征在于， 其包括如权利 要求1所述的TIGIT基因RNAi靶序列、 如权利 要 求2所述的基于所述TIGIT基因RNAi靶序列的干扰序列、 或如权利要求5所述的表达载体质 粒。 8.一种TIGIT基因干扰 的嵌合抗原受体NK细胞， 其特征在于， 通过RNA干扰(RNAi)手段 对TIGIT基因进行干扰， 敲低T IGIT表达量； 所述干扰序列如SEQ  ID NO.2、 3、 7、 8、 9、 10所示， 对嵌合抗原受体NK细胞进行改造 。 9.一种试剂盒、 药物 组合物或制剂， 其特征在于， 其包括如权利 要求1所述的TIGIT基因 RNAi靶序列、 如权利要求2所述的基于所述TIGIT基因RNAi靶序列的干扰序列、 或如权利要 求5所述的表达载体质粒、 如权利要求7 所述的细胞。 10.如权利要求1所述的TIGIT基因RNAi靶序列、 如权利要求2所述的基于所述TIGIT基 因RNAi靶序列的干扰序列、 如权利要求5所述的表达载体质粒、 如权利要求7所述的细胞、 如 权利要求9所述的试剂盒或药物组合物或制剂在制备治疗CAR ‑NK的药物中的应用、 在制备 治疗实体瘤疾病的药物中的应用、 在制备恶性肿瘤疾病免疫治疗药物中的应用、 在制备靶 向治疗胰腺癌的药物中的应用、 在制备提高NKG2D ‑CAR‑NK细胞的活化水平的药物中的应 用、 在制备增强NKG2D ‑CAR‑NK细胞肿瘤 细胞杀伤能力的药物中的应用。 11.如权利要求10的应用， 其特 征在于， 所述应用包括在体外、 在体内。 12.一种非诊断和/或治疗目的的增强NKG2D ‑CAR‑NK细胞肿瘤细 胞杀伤能力的方法， 其 特征在于， 其通过敲低TIGIT以提高NKG2D ‑CAR‑NK细胞的活化水平， 增强其对肿瘤细胞的杀 伤能力。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114836428 A 213.一种用于非治疗目的的抑制细胞内目标基因的表达的方法， 其特征在于， 其包括将 如权利要求2所述的干扰序列导入所述细胞内的步骤， 或使如权利要求2所述的干扰序列在 所述细胞内表达的步骤。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114836428 A 3