(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210646861.1 (22)申请日 2022.06.09 (71)申请人 中国药科大学 地址 210009 江苏省南京市童家巷24 号 (72)发明人 梁宏伟　曾科　 (74)专利代理 机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 专利代理师 傅婷婷　徐冬涛 (51)Int.Cl. C12N 5/078(2010.01) A61K 39/00(2006.01) A61K 47/46(2006.01) A61K 47/42(2017.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种靶向巨噬细胞递送用无核细胞及其制 备方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种靶向巨噬细胞递送用无 核细胞及其制备方法和应用。 通过自体蛋白包裹 抗原蛋白或RNA将抗原蛋白或RNA疫苗递送入红 细胞或血小板中， 随后通过紫外辐射等手段诱导 红细胞或血小板膜表面CD47分子发生改变， 使红 细胞或血小板老化。 包裹了抗原蛋白或RNA疫苗 的老化的红细胞或血小板注射入体内后会主动 迁移至脾、 骨髓和肝等处被巨噬细胞吞噬。 巨噬 细胞作为抗原递呈细胞， 吞噬包裹了抗原蛋白或 RNA疫苗的老化的红细胞或血小板后会启动抗原 递呈过程， 递呈包裹的抗原,进一步诱导机体产 生针对该抗原的特异性T细胞或B细胞， 从而产生 相应的特异性T细胞或抗体， 从而保护机体免于 感染或杀伤表达相应抗原的微 生物或细胞。 权利要求书1页 说明书11页 附图13页 CN 115029311 A 2022.09.09 CN 115029311 A 1.一种靶向巨噬细胞递送抗原蛋白或RNA 的无核细胞的制备方法， 其特征在于包含以 下步骤： 通过自体蛋白包裹抗原蛋白或RNA， 将其递送入红细胞或血小板中， 随后诱导红细 胞或血小板膜表面CD47分子低表达， 使红细胞或血小板 老化获得靶向巨噬细胞递送抗原蛋 白或RNA的无核细胞。 2.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述的诱导红细胞或血小板膜表面 CD47分子低表达的方法选自以下任意一种： UV辐射5 ‑7小时， 1‑2uM PMA处理， 180 ‑220uM  CaCl2处理， 80‑120nM CPG处理， 90‑110nM polyIC处理， 或3‑5℃静止25 ‑32天。 3.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 所述的诱导红细胞或血小板膜表面 CD47分子低表达的方法选自以下任意一种： UV辐射6小 时， 1.5uM  PMA处理， 200uM  CaCl2处 理， 100nM CPG处理， 100nM polyIC处理， 或4℃静止 30天。 4.根据权利要求1所述的制备 方法， 其特 征在于， 所述的自体蛋白为血浆蛋白。 5.根据权利要求1 ‑4中任一项所述的制备 方法， 其特 征在于， 包 含以下步骤： (1)利用红细胞或血小板包裹抗原蛋白或RNA： (a)分离并收集红细胞或血小板； (b)将 抗原蛋白或RNA加入血浆溶液孵育， 将收集的红细胞或血小板用血浆溶液重悬； (c)向红细 胞或血小板的血浆溶液中加入抗原蛋白或RNA的血浆溶液， 混合均匀， 培养后离心收集包裹 抗原蛋白或RNA的红细胞或血小板； (2)降低红细胞或血小板表面CD47分子表达： 将上一步制备好的包裹了抗原蛋白或RNA 的红细胞或血小板分别用以下任意一种方式进行处理使红细胞或血小板老化获得靶向巨 噬细胞递送抗原蛋白或RNA的无核细胞： UV辐射5 ‑7小时， 1‑2uM PMA处理， 180 ‑220uM CaCl2 处理， 80‑120nM CPG处理， 90‑110nM polyIC处理， 或3‑5℃静止25 ‑32天。 6.按照权利要求1 ‑4中任一项所述的制备方法制备得到的靶向巨噬细胞递送抗原蛋白 或RNA的无核细胞。 7.权利要求6所述的无核细胞在制备蛋白类药物或RNA疫苗中的应用。 8.权利要求6所述的无核细胞在制备抗肿瘤的蛋白类药物或RNA疫苗中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115029311 A 2一种靶向巨噬细胞递 送用无核细胞及其制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明涉及一种靶向巨噬细胞递送用无核细胞及其制备 方法和应用。 背景技术 [0002]疫苗是人类医学发展史上的里程碑， 是人类控制传染病的主要手段， 被视为20世 纪最伟大 的公共卫生成就之一。 疫苗的发展历经多次技术革命， 疫苗逐渐从传统的预防功 能， 逐渐演变为集预防和治疗为一体的多功 能新型生物技术。 无论是以蛋白为主的蛋白类 疫苗， 还是以RNA为主的mRNA疫苗， 其要想发挥功能激活人体免疫反应， 产生特异性保护抗 体或T细胞， 都必须通过胞外屏障、 逃脱内体逃逸与胞内免疫， 并被抗原 提呈细胞吞噬。 为了 达到这一目的， 目前往往采用病毒载体 或以脂质体及其衍生物为代表的非病毒载体的方法 将蛋白类疫苗或mRNA疫苗导入 人体。 然而， 无论是病毒 载体还是非病毒 载体， 由于其 都不会 将蛋白类疫苗和mRNA疫苗靶向递送于抗原 提呈细胞， 反而会在肝脏、 脾脏等脏器聚集， 因此 其不仅在很大程度上限制 了疫苗的效率， 而且还可能诱发严重的副作用。 为了使疫苗发挥 更高的效率、 避免副作用的发生， 迫切需要研发新的疫苗 递送方法。 [0003]成年人每毫升血液中红细胞(RBC)的数量是400万到550万， 血小板(platelet)的 数量是10万 ‑30万。 红细胞和血小板都是无核的， 其中红细胞的半衰期约120天， 血小板的半 衰期约7～9天。 红细胞和血小板膜蛋白CD47通过与巨噬细胞表面分子SIRPα相互作用抑制 巨噬细胞对红细胞和血小板的吞噬。 凋亡、 老化的红细胞和血小板膜蛋白CD47发生改变， 无 法通过作用于巨噬细胞表面分子SIRPα而抑制巨噬细胞对红细胞和血小板的吞噬。 体内凋 亡、 老化的红细胞和血小板会主动迁移至脾、 骨髓和肝 等处被巨噬细胞 吞噬。 发明内容 [0004]本发明的目的就是提供靶向巨噬细胞递送抗原蛋白或RNA的无核细胞的制备方 法。 [0005]本发明的另一目的是提供按照上述方法制备的靶向巨噬细胞递送抗原蛋白或RNA 的无核细胞。 [0006]本发明的又一目的是提供靶向巨噬细胞递送抗原蛋白或RNA的无核细胞的应用。 [0007]本发明的目的可通过以下技 术方案实现: [0008]本发明通过自体蛋白包裹抗原蛋白或RNA疫苗形成的纳米颗粒将抗原蛋白或RNA 疫苗递送入红细胞或血小板中， 随后通过紫外辐射等手段诱导红细胞或血小板膜表面CD47 分子发生改变， 使红细胞或血小板 老化。 包裹了抗原蛋白或RNA疫苗的老化的红细胞或血小 板注射入体内后会主动迁移至脾、 骨髓和肝等处被巨噬细胞吞噬。 巨噬细胞作为抗原递呈 细胞， 吞噬包裹了抗原蛋白或RNA疫苗的老化的红细胞或血小板后会启动抗原 递呈过程， 递 呈包裹的抗原(抗原蛋白蛋白酶解后直接递呈； RNA疫苗在巨噬细胞内表达出相应抗原蛋白 后再递呈),进一步诱导机体产生针对 该抗原的特异 性T细胞或B细胞， 从而产生相应的特异 性T细胞或抗体， 从而保护机体免于感染或杀伤 表达相应抗原的微 生物或细胞。说　明　书 1/11 页 3 CN 115029311 A 3