(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210662071.2 (22)申请日 2022.06.13 (71)申请人 浙江理工大 学 地址 310018 浙江省杭州市钱塘区2号大街 928号浙江理工大 学 (72)发明人 刘锋　王秉　丁传苗　邓烨丰　 胡铭周　彭志勤　万军民　 (74)专利代理 机构 浙江永航联科专利代理有限 公司 33304 专利代理师 张进 (51)Int.Cl. A61K 41/00(2020.01) A61K 9/52(2006.01) A61K 47/42(2017.01) A61K 47/24(2006.01)A61P 35/00(2006.01) A61K 49/22(2006.01) (54)发明名称 一种联合光疗-免疫治疗的纳米粒子的制备 方法 (57)摘要 本发明涉及生物医药领域， 本发明公开了一 种联合光疗 ‑免疫治疗的纳米粒子的制备方法， 本发明首先通过液相机械剥离法和差速离心得 到锑烯纳米颗粒， 再利用牛血清白蛋白包覆在锑 烯纳米颗粒表面， 最后用细菌外膜囊泡@二硬脂 酰基磷脂酰乙醇胺 ‑聚乙二醇与其连接起来， 得 到锑烯纳米颗粒@牛血清白蛋白 ‑二硬脂酰基磷 脂酰乙醇胺 ‑聚乙二醇 ‑细菌外膜囊泡纳米粒子。 该方法得到的纳米粒子具有多功能性， 可以实现 光声成像， 光热/光动力/化疗/免疫反应四协同 治疗， 可增加以锑烯为基体的纳米药物的稳定 性， 增强抗肿瘤的效果， 有望实际运用于肿瘤治 疗。 权利要求书2页 说明书5页 CN 115105593 A 2022.09.27 CN 115105593 A 1.一种联合 光疗‑免疫治疗的纳米粒子的制备 方法， 其特 征在于包括以下步骤： （1） 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺 ‑聚乙二醇溶液的配制： 将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺 ‑聚 乙二醇溶于去离子水， 配制成1 ‑2mg/mL的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺 ‑聚乙二醇溶液， 冷藏备 用； （2） 细菌外膜囊泡的制备： 将冻存的细菌标准株接种于琼脂平板， 孵育， 挑取单个菌落 于无菌LB液体中摇床培养； 转移至无菌 LB液继续培养至D600nm为1.0； 将所得的培养至对数生 长期的菌液离心处理， 收集上清液； 过滤上清液， 将过滤后的上清液用超滤离心管离心处 理， 重复若干次， 直至最后液体体积为原体积的1/8~1/4； 将浓缩后所得上清液转移至无菌 超速离心管， 超速 离心， 弃去上清液， 将沉淀 重悬于Hepes缓冲液中， 保存； （3） 牛血清白蛋白溶液的配制： 向牛血清白蛋白加入水， 配制成1 ‑2mg/mL的牛血清白蛋 白溶液， 锡纸包封后冷藏备用； （4） 锑烯纳米颗粒分散液的制备： 取锑粉2 ‑4g分散于40 ‑80mL N‑甲基‑2‑吡咯烷酮中， 对容器封口后， 用超声波探头冰浴超声处理， 接着在 超声清洗器中冰浴超声处理， 最后用超 声波细胞粉碎仪超声处理； 8 ‑10℃下将所得分散液离心， 弃去沉积的块状锑， 再离心， 收集 沉淀， 加入10 ‑15mL去离 子水得到锑烯纳米颗粒分散液， 冷藏备用； （5） 将步骤 （4） 所得锑烯纳米颗粒分散液进行稀释后配制成浓度为1 ‑2mg/mL的锑烯纳 米颗粒稀释分散液； （6） 取0.5 ‑1mL牛血清白蛋白溶液加入到0.5 ‑1mL锑烯纳米颗粒稀释分散液中， 搅拌， 超 声， 离心， 收集 沉淀， 加入1 ‑2ml去离子水得到锑烯纳米颗粒@牛 血清白蛋白分散液； （7） 细菌外膜囊泡功能化： 用mini ‑extruder通过聚碳酸酯膜挤压细菌外膜囊泡与二硬 脂酰基磷脂酰乙醇胺 ‑聚乙二醇分散液的混合液， 在1 ‑5℃下进行离心， 去除上清液后重悬， 制备得到细菌 外膜囊泡@二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺 ‑聚乙二醇 分散液； （8） 纳米粒子的制备： 将步骤 （6） 的锑烯纳米颗粒@牛血清白蛋白分散液与 步骤 （7） 的细 菌外膜囊泡@二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺 ‑聚乙二醇分散液混合， 搅拌， 超声， 离心， 收集沉淀， 制备得到锑烯纳米颗粒@牛血清白蛋白 ‑二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺 ‑聚乙二醇 ‑细菌外膜囊 泡纳米粒子 。 2.如权利要求1所述的制备方法， 其特征在于： 步骤 （2） 具体包括： 将冻存的细菌标准株 接种于琼脂平板， 35 ‑40℃孵箱孵育20 ‑30 h， 挑取单个菌落于无菌LB液体35 ‑40℃摇床 培养 12‑18 h； 转移至无菌LB液继续培养至D600nm为1.0； 将所得的培养至对数生长期的菌液以 800‑1200×g离心处理5 ‑15min， 收集上清液； 用0.22 μm的滤菌器过滤上清液， 将过滤后的上 清液用截留相对分子质量80000 ‑120000的超滤离心管以3500 ‑4500×g离心处理5‑15min， 重复若干次， 直至最后液体体积为原体积的1/8~1/4； 将浓缩后所得上清液转移至无菌超速 离心管， 38000 ‑40000×g超速离心50 ‑70 min， 弃去上清液， 将沉淀重悬于1 ‑2 mL 45‑55  mmol/L的Hepes缓冲液中， 1 ‑5℃保存。 3.如权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 （4） 中， 首次离心转速为2000 ‑ 4000rpm， 离心时间为10 ‑15min； 第 二次离心转速为8000 ‑12000rpm， 离心时间为30 ‑35min； 离心温度不超过10℃。 4.如权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 （4） 中， 所述超声波探头的规格为φ 4‑8， 冰浴超声时间为8 ‑10h， 功率为800 ‑1200w， 每超声2 ‑4s停1s； 所述超声清洗器冰浴超声权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115105593 A 2的时间为2 ‑3h， 功率为200‑400w； 所述超声 波细胞粉碎仪冰浴超声时间为2 ‑3h。 5.如权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 （1） 、 步骤 （3） 和步骤 （4） 中， 所述冷 藏的温度为1 ‑5℃。 6.如权利 要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 （6） 中， 所述搅拌的时间为8 ‑12h； 离 心转速为10 000‑12000rpm， 离心时间为3 ‑5min。 7.如权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 （7） 中， 细菌外膜囊泡@二硬脂酰基 磷脂酰乙醇胺 ‑聚乙二醇与锑烯纳米颗粒@牛 血清白蛋白的质量比为1 ‑2:1。 8.如权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 （7） 中， 所述聚碳酸酯膜厚度为50 ‑ 150nm， 挤出次数为10 ‑20， 制备温度为20 ‑30℃， 每次离心时间为3 ‑7min， 离心转速为12 000‑ 15000×g。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115105593 A 3