(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210662021.4 (22)申请日 2022.06.13 (71)申请人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘 路866号 (72)发明人 余日胜　卢园飞　杜永忠　周佳萍　 周巧妹　杨晓艳　余洁倪　 (74)专利代理 机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 专利代理师 郑海峰 (51)Int.Cl. A61K 9/51(2006.01) A61K 47/24(2006.01) A61K 47/52(2017.01) A61K 41/00(2020.01)A61K 31/713(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/04(2006.01) A61K 49/12(2006.01) B82Y 5/00(2011.01) B82Y 40/00(2011.01) (54)发明名称 一种pH敏 感超薄水滑石联合Nr2f6 siRNA纳 米片及其制备方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种pH敏感超薄水滑石联合 Nr2f6siRNA纳米片及其制备方法和应用， 所属纳 米片包含超薄水滑石， Nr2f6siRNA和pH敏感物 (聚乙二醇修饰二甲基马来酸酐， PEG ‑DMMA)。 本 发明得到水滑石通过对肿瘤微环境的pH响应同 时传递Nr2f6siRNA 至免疫细胞和癌 细胞， 双重调 节改善肝癌抑制性免疫微环境， 对肝癌细胞具有 显著的抑制作用。 该纳米具有较低的背景毒性， 且具有光热效应， 在双模态MRI成像指导下实现 对肝癌靶向成像及干预的一体化， 为肝癌治疗开 辟了新途径。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图4页 CN 115006370 A 2022.09.06 CN 115006370 A 1.一种pH响应超薄铜钴铁水滑石复合Nr2f6  siRNA纳米片的制备方法， 其特征在于， 包 括如下步骤： 1)将Cu(II)盐， Co(II)盐和Fe(III)盐溶于DEPC水中， 形成均匀溶液A； 将NaNO3溶于含甲 酰胺的DEPC水中形成溶 液B； 将NaOH溶于DEPC水中形成溶 液C； 2)溶液A和溶液C缓慢地添加到溶液B中， 搅拌， 离心， 然后进一步透析以除去甲酰胺， 得 到超薄铜钴铁水滑石胶体溶 液； 3)将超薄铜钴铁水滑石胶体溶液与Nr2f6  siRNA进行吸附， 得到负载siRNA超薄铜钴铁 水滑石胶体溶 液； 4)在pH 8.5的PBS中， 溶解NH2–PEG， 将DMMA缓慢加入溶液中； 在室温下反应， 反应结束 后， 在水中透析， 再冷冻干燥， 得到PEG ‑DMMA； 5)将步骤4)得到的PEG ‑DMMA和步骤3)得到的负载siRNA超薄铜钴铁水滑石胶体溶液混 合吸附， 得到pH响应超薄铜钴铁水滑石复合 Nr2f6 siRNA纳米片。 2.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤1)的溶液A中， Cu和Co的总和与Fe 的摩尔比为2 ‑4： 1； Cu与Co的摩尔比为0.2 ‑0.5： 1。 3.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤5)中， PEG ‑DMMA与负载siRNA超薄 铜钴铁水滑石胶体溶 液中溶质的质量比为3 ‑5： 1。 4.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， Nr2f6  siRNA正义链的碱基序列如SEQ   ID No.1所示， 反义链的碱基序列如SEQ  ID No.2所示。 5.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤3)中， 超薄铜钴铁水滑石胶体溶 液中溶质和Nr 2f6 siRNA的质量比为 40‑120： 1。 6.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述的Cu盐、 Co盐和Fe盐均为硝酸盐 或其水合物； B溶液中甲酰胺含量为20 ‑30％， 溶液C中NaOH与溶液A中的金属盐溶液中的总 金属离子摩尔比为6 ‑7： 1； 步骤2中， 溶 液A、 溶液B、 溶液C的体积用量比为1:1： (1 ‑1.5)。 7.根据权利 要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤2)中， 透析截留分子量3kDa； 步骤 4)中透析截留分子量8kDa。 8.根据权利要求1所述的制备 方法， 其特 征在于， 反应过程需要全程 通氮气保护。 9.权利要求1 ‑8任一项所述方法制 备得到的pH敏感超薄水滑石联合Nr2f6  siRNA纳米 片。 10.权利要求9所述的pH敏感超薄水滑石联合Nr2f6  siRNA纳米片在制备预防和/或治 疗肝癌的药物中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115006370 A 2一种pH敏感超薄 水滑石联合Nr2f6  siRNA纳米片及其制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明属纳米给药系统的制备， 具体涉一种p H敏感超薄水滑石联合Nr2f6siRNA纳 米片及其制备 方法和应用。 背景技术 [0002]肝细胞肝癌(HCC)是全球范围内第六大高发癌症和第四大癌症相关死亡原因， 每 年约有841,000例新病例和782,000例死亡病例。 2018年我国癌症数据统计显示， 36.4％的 癌症相关死亡的百分比来自消化道癌症(胃癌,HCC和食管癌)， 其中HCC作为中国第四大常 见癌症， 严重威胁人民的生命和健康。 尽管我们对HCC实施了广泛的监测 计划， 但仍有超过 一半的HCC患者在确诊时就已为晚期， 并丧失了进行根治性手术切除的机会。 同时， 不论就 诊时患者处于 哪个阶段或者接受了以上几种联合治疗， 肿瘤复发和治疗后再发新癌灶仍是 目前存在的主要问题。 之前的研究表明， 尽管患者在早期 HCC阶段接受了根治性切除或消融 治疗， 但由于肿瘤微环 境(TME)等因素对肿瘤生物学行为的影响， 高达70％的HCC患者5年内 复发。 通过 单一纳米载体同时影响肿瘤微环境和癌细胞， 递送siRNA,是一种新的治疗方案 。 [0003]层状双氢氧化物(LDHs)， 作为一种具有较好生物相容性和可生物降解的2D纳 米材 料， 是构建多功能纳米平台的理想选择。 LDHs通式[[M2+ 1‑xM3+ x(OH)2]x+(An‑)x/n·mH2O,,M代表 形成氢氧化物层的二价和三价金属离子， 如钴(Co)等， An ‑表示层间相互作用的可交换阴离 子。 这一独特结构， 使得各种功能性金属阳离子能够被掺进用于影像成像、 药物递送、 基因 保护等。 同时， 金属离子的OH基团的配位使LDH对弱酸性溶液敏感， 在酸性环境中易生物降 解释放出与生物相容性阳离子和H2O， 最大限度地减少试剂长期体内蓄积风险， 并促进药物 释放， 增强治疗效果。 [0004]带正电荷的LDH显示出对癌细胞膜的高亲和力的同时， 容易在生理环境中与血清 成分产生 非特异性相互作用， 并被网状内皮系统快速清除。 聚乙二醇(P EG)化可在空间上稳 定纳米颗粒， 从而减少体内的非特异 性相互作用， 延长循环时间， 并通过增强 高渗透长滞留 效应促进了纳米粒在肿瘤的蓄积。 然而， PEG化会强烈抑制细胞摄取， 导致递送活性的显着 损失。 常见的酰胺键一般是不可降解的， 或者仅在极端的pH值下才能降解， 但是马来酸酰胺 (DMMA)衍生物的酰胺键可在弱酸性pH值下断裂。 利用DMMA在肿瘤微酸环境中电荷逆转， 使 静电吸附在LDH上的PEG在酸 性环境中脱离， 来改善体内siRNA的传递， 是一个可 行的策略。 发明内容 [0005]本发明的目的是克服现有技术的不足， 本发明提供了一种pH敏感超薄水滑石联合 Nr2f6 siRNA纳米片及其制备方法和应用。 本发明将Cu2+掺入CoFe ‑LDHs,形成单层三元 CoCuFe‑LDHs(CCF)作为纳米核静电吸附siRNA， 用PEG ‑DMMA做壳， 增加LDH在体 内循环时间 并响应肿瘤微 酸环境进行核 ‑壳分离， 高效递送基因到肝癌细胞和免疫细胞。 [0006]本发明的第一个目的在 于提供一种 pH敏感超薄水滑石联合Nr2f6  siRNA纳米片的说　明　书 1/5 页 3 CN 115006370 A 3