(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210660533.7 (22)申请日 2022.06.13 (71)申请人 珠海善行免疫微 生态产业研究院有 限公司 地址 519000 广东省珠海市高新区唐家湾 镇金唐路1号港湾1号科创园2 4栋C区1 层134室(集中办公区) (72)发明人 何学松　王京苏　王盛洲　 (74)专利代理 机构 南昌大牛知识产权代理事务 所(普通合伙) 36135 专利代理师 刘俊文 (51)Int.Cl. C07F 9/6539(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12N 5/0783(2010.01) (54)发明名称 磷酸抗原化合物及其制备方法和用于Vγ9V δ2T细胞的培 养方法 (57)摘要 本发明公开了磷酸抗原化合物及其制备方 法和用于V γ9Vδ2T细胞的培养方法。 P TA都通三 步法合成， 然后将其用于V γ9Vδ2T细胞的培养， 具体包括(1)激活； (2)扩增； 和(3)收获步骤。 本 发明合成的PTA是一种疏水性的药物前体， 可以 穿透细胞膜， 进入细胞质内， 在脂酶的作用下分 解成为药物活性成分TA、 戊醛酸、 甲醛， 激活γδ T细胞。 基于P TA进行的γδT细胞的培养， 可以显 著的提高了γδT细胞纯度和数量， 同时降低了 γδT细胞凋亡， 为γδT细胞治疗肿瘤的临床应 用奠定基础。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 114891038 A 2022.08.12 CN 114891038 A 1.一种磷酸 抗原化合物PTA， 其特 征在于， 其结构如式I所示： 2.一种权利要求1所述的磷酸抗原化合物PTA的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 通过二乙胺、 甲醛、 亚甲基二磷酸四甲酯反应合成亚乙烯基 ‑1,1‑二膦酸四甲酯， 将其溶于 乙腈溶液中后， 加入碘化钠和新戊酸氯甲酯， 合 成得到四新戊酰氧基甲基亚乙烯基 ‑1,1‑二 膦酸酯； 然后将其溶于三氯甲烷溶 液中后再与2 ‑氨基噻唑反应， 得到PTA。 3.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 二乙胺： 甲醛： 亚甲基二磷酸四甲酯＝ 60mmol： 300mmol： 60mmol； 碘化钠： 新戊酸氯甲酯： 亚乙烯基 ‑1,1‑二膦酸四甲酯＝68mmol： 85mmol： 17mmol； 新戊酰氧基甲基亚乙烯基 ‑1,1‑二膦酸酯： 2 ‑氨基噻唑＝0.1mmol： 0.2mmol。 4.一种扩增Vγ9 V δ2T细胞的培 养方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)激活： 从外周血中分离PBMC， 重悬于含10％FBS的RPMI ‑1640培养基中， 使外周血单 个核细胞的细胞浓度为1 ×106个/mL， 同时添加权利要求1所述的PTA、 IL ‑2、 IL‑15、 静置培 养3天； (2)扩增： 添加培养基稀释细胞浓度至5 ×105个/mL， 同时添加IL ‑2、 IL‑15， 静置培养6至 11天； (3)收获： 将培养的Vγ9Vδ2T细胞培养基收集， 离心， 所得沉淀即是成熟的Vγ9Vδ2T细 胞。 5.根据权利要求4所述的培养方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 添加组分后的培养基PTA 浓度为1‑100 μM， IL‑2浓度为10 0‑1000IU/mL， I L‑15浓度为10 0‑1000IU/mL。 6.根据权利 要求4所述的培养方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 添加组分后的培养基IL ‑2 浓度为10 0‑1000IU/mL， I L‑15浓度为10 0‑1000IU/mL。 7.根据权利 要求4所述的培养方法， 其特征在于， 所述步骤(1)和(2)中的静置培养条件 为： 温度为37℃、 CO2体积百分比含量 为5％、 相对饱和湿度为10 0％。 8.根据权利要求4所述的培养方法， 其特征在于， 所述步骤(3)还包括将制得的Vγ9Vδ 2T细胞经离心后， 重悬于 保存液中， 所述保存 液含有如下 组分： 体积百分比为20％的人血清 白蛋白5mL， 0.9wt％氯化钠溶 液定容至10 0mL。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114891038 A 2磷酸抗原化合物及其制备方 法和用于V γ9Vδ2T细胞的培养 方法 技术领域 [0001]本发明属于免疫细胞体外培养技术领域， 具体涉及一种磷酸抗原化合物PTA及其 制备方法和用于Vγ9 V δ2T细胞的培 养方法。 背景技术 [0002]肿瘤过继性免疫疗法是将致敏淋巴细胞(具有特异免疫力)或其产物输给细胞免 疫功能低下者(如肿瘤病人)， 使其 获得抗肿瘤免疫力， 它是用来治疗肿瘤的一种免疫疗法。 1985年美国国家癌症研究委员会将癌症的免疫疗法确立为 继外科手术、 放射疗法和化学药 物疗法之后的第四种疗法。 [0003]根据T细胞表面TCR的类型， 可将T细胞分为α β T细胞和γδT细胞两类。 其中α β T细胞 即通常所称的T细胞， 其表面表达TCRα β， 占T细胞总数的95％以上； 而γδT细胞表 面表达TCR γδ。 γδT细胞是1986年被发现的， 在疾病初始阶段具有快速、 直接 反应的能力， 在天然免疫 反应中扮演重要角色。 γδT细胞是一类不同于α β T细胞的主要T细胞亚群， 是人体内联系固 有免疫和适应性免疫之间的桥梁。 γδT细胞的Vγ9V δ2亚群主要存在于外周血中， 对肿瘤细 胞具有直接细胞毒性， 能通过直接杀伤作用和释放细胞 因子来共同控制肿瘤细胞的生长和 转移， 其杀伤作用不依赖于MHC分子。 因此， 近年来γδT细胞技术开始涌现入临床， 用于肿瘤 细胞的治疗。 [0004]然而外周血中的γδT细胞只占整个淋巴亚群的1％ ‑5％， 数量稀少， 需要经过体外 刺激扩增后， 方可取得足够的细胞， 供临床使用。 目前常用含氮的膦酸抗原如唑来膦酸 (zol)来激活γδT细胞。 唑来膦酸， 化学名为1 ‑羟基‑2‑(咪唑‑1‑基)‑亚乙基‑1,1‑二磷酸， 是一种二膦酸盐药物， 用于治疗肿瘤骨转移及预防骨骼并发症。 Zol含P ‑C‑P结构， 带负电 荷， 因此需要 液相胞吞作用， 从而被巨噬细胞和递呈细胞所吞噬进入细胞质。 在细胞质中与 脂代谢过程中法尼基二磷酸合 酶(FPPS)结合， 抑制法尼基二磷酸(FPP)产生， 导致代谢上游 的异戊烯焦磷酸(IPP)累积， IPP通过嗜乳脂蛋白家族BTN3A1与TCRγδ结合， 激活γδT细胞； 然而Zol所带负电荷由于需要液相胞饮才能进入细胞， 限制了zol在细胞质的浓度， 从而需 要较高浓度的zol才 能有效激活γδT细胞。 然而高浓度的zol会导致γδT细胞凋亡， 从而限 制了γ δT细胞的扩增数量。 发明内容 [0005]本发明利用化学合成的方法， 合成了PTA， PTA 是一种疏水性的药物前体， 可以穿透 细胞膜， 进入细胞质内， 在脂酶的作用下分解 成为药物活性 成分TA、 戊醛酸、 甲醛， TA与FPPS 结合， 抑制FPP产生， 导致代谢上游的IPP累积， IPP通过BTN3A1与TCRγδ结合， 激活γδT细 胞。 本发明公开了PTA的合 成方法， 以及用PTA进行γδT细胞的合 成， 可以显著的提高了γδT 细胞纯度和数量， 同时降低了γ δT细胞凋亡， 为γ δT细胞治疗肿瘤的临床应用， 奠定基础。 [0006]具体采用以下的技 术方案：说　明　书 1/4 页 3 CN 114891038 A 3