(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210661119.8 (22)申请日 2022.06.13 (71)申请人 东北农业大 学 地址 150030 黑龙江省哈尔滨市香坊区长 江路600号 (72)发明人 孟祥晨　刘利军　尚佳萃　陈禹含　 杨硕　 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) A61K 35/744(2015.01) A61K 35/745(2015.01) A61P 1/00(2006.01) A61P 1/04(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的 乳酸菌混合物及其应用 (57)摘要 本发明开发一种具有缓解结肠炎相关结直 肠癌作用的乳酸菌混合物及其应用。 混合物包括 两歧双歧杆菌H3 ‑R2和乳酸乳球菌KLDS4.0325 (活菌数1:1)。 评估了两菌及其混合物对结肠癌 HT‑29细胞的影响， 发现三者均可抑制HT ‑29细胞 增殖， 上调Caspase ‑3、 Caspase ‑9和Bax， 下调 Bcl‑2， 促进HT ‑29细胞凋亡。 探究了两菌及其混 合物对AOM/DSS诱导的结肠炎相关结直肠癌小鼠 的影响。 发现显著降低了结肠缩短、 髓过氧化物 酶(MPO)活性以及HIF ‑1α水平； 改善了CAC小鼠 结肠组织学损伤， 并表现出较低的白介素 ‑6(IL‑ 6)、 白介素 ‑1β(IL‑1β)、 白介素 ‑22(IL‑22)、 白 介素‑17(IL‑17)和肿瘤坏死因子 ‑α(TNF‑α)水 平， 同时上调了结肠和血清中抗炎细胞因子IL ‑ 10的水平。 此外， 两菌联合使用能增加结肠紧密 连接蛋白(ZO ‑1、 Claudi n‑1和Occludin)的表达 。 权利要求书2页 说明书7页 附图10页 CN 115011518 A 2022.09.06 CN 115011518 A 1.一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其应用， 其特征在于， 该 方法包括以下步骤： (1)菌株的培养： 混合菌悬液是将H3 ‑R2与KLDS  4.0325以活菌数1:1比 例混合。 (2)体外评估两菌及其混合物对结肠癌HT ‑29细胞的增殖抑制及促凋亡作用： 通过 CCK‑8法检测菌株对HT ‑29细胞的增殖抑制作用； 通过流式细胞仪检测细胞凋亡； 通过RT ‑ qPCR检测HT ‑29细胞凋亡相关mRNA表达； 通过Western  blot检测HT‑29细胞凋亡相关蛋白表 达。 (3)利用AOM/DSS诱导的小鼠模型评估受试菌株对CAC的作用效果： 使用雄性5周龄 C57BL/6J小鼠， 饲养温度23 ±2℃， 湿度55 ±5％， 12h交替光照。 将60只小鼠试喂养1周后随 机分为6组： 正常组(NC)、 模型组(MC)、 阳性对照组(PC)、 两歧双歧杆菌H3 ‑R2组(BH)、 乳酸乳 球菌KLDS4.0325组(LK)以及H3 ‑R2加KLDS4.0325混菌组(BL)。 对不同组小鼠体重、 脾脏指 数、 结肠组织状态、 结肠组织髓过氧化物酶(MPO)活力、 缺氧诱导因子(HIF ‑1α )、 血清及结肠 组织中的细胞因子、 紧密连接蛋白、 Ki67免疫组化以及NLRP3信号通路相关基因mRNA的表达 水平进行测定， 并对小鼠肠道菌群进行分析。 2.根据权利要求1所述的一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其 应用， 其特征在于， 所述的两歧双歧杆菌H3 ‑R2和乳酸乳球菌乳酸亚种KLDS  4.0325由实验 室自行分离， 保藏于东北农业大 学乳品科 学教育部重点实验室。 3.根据权利要求1所述的一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其 应用， 其特征在于， 所述的Western  blot检测HT‑29细胞凋亡相关蛋白表达结果为： BH、 LK以 及BL处理 的Caspase ‑3、 Caspase ‑9和Bax蛋白水平显著高于正常对照组， Bcl ‑2蛋白水平显 著低于正常对照组， 其中BL组调节蛋白表达效果 最显著。 4.根据权利要求1所述的一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其 应用， 其特征在于， 所述的结肠长度及结肠组织状态为： 从盲肠至近肛门处的长度， NC组平 均结肠长度为7.9 ±0.29cm， MC组平均结肠长度为5.83 ±0.28cm； 与NC组和PC组相比， BH、 LK 以及BL组的小鼠结肠均有不同程度缩短， 但 仍显著高于模 型组； AOM/DSS处理导致小鼠结肠 上皮结构破坏， 炎症细胞大量浸润， 杯状细胞大量减少， 隐窝结构发生扭曲， 隐窝形状不规 则甚至消失； PC组小鼠结肠保留了大量的杯状细胞， 炎症细胞浸润不明显； 与MC组相比， 三 个处理组小鼠的炎症细胞浸润水平较低， 黏膜结构良好， 隐窝形状相对比较规则。 5.根据权利要求1所述的一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其 应用， 其特征在于， 所述的小鼠脾脏指数为： 两歧双歧杆菌H3 ‑R2与乳酸乳球菌KLDS4.0325 联合使用能够改善小鼠由于AOM /DSS刺激引起的小鼠脾脏肿大。 6.根据权利要求1 ‑2所述的一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及 其应用， 其特征在于， 所述的结肠 组织髓过氧化物酶(MPO)活力为： NC组小鼠结肠组织中的 MPO活性为(0.045 ±0.01)U/g， 用AOM/DSS处理小鼠后， MPO活性显著增加至(0.095 ±0.01) U/g。 BH与BL处 理组均能显著降低CAC小鼠结肠的MPO活性， 且与PC组的MPO活性无显著差异。 7.根据权利要求1所述的一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其 应用， 其特征在于， 所述的结肠组织缺氧诱导因子(HIF ‑1α )浓度为： AOM/DSS 处理显著增加 了小鼠结肠中HIF ‑1α 水平。 与M C组相比， BH组、 LK组以及 BL组的HIF ‑1α 含量显著降低。 8.根据权利要求1所述的一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其 应用， 其特征在于， 所述的血清及结肠组织细胞因子含量为： 两歧双歧杆菌H3 ‑R2与乳酸乳 球菌KLDS4.0325单独或联合使用均可不 同程度增加IL ‑10浓度， 降低IL ‑6、 TNF‑α、 IL‑1β、权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115011518 A 2IL‑17和IL‑22的浓度。 9.根据权利要求1所述的一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及其 应用， 其特征在于， 所述的紧密连接蛋白及Ki67免疫组化结果： 两歧双歧杆菌H3 ‑R2联合乳 酸乳球菌KLDS4.0325使用可增加结肠紧密连接蛋白表达(ZO ‑1， Occludin和Claudin ‑1)， 改 善肠道屏障功能。 并可显著减少AOM /DSS小鼠结肠中的Ki67的表达 。 10.根据权利要求1所述的一种具有缓解结肠炎相关结直肠癌作用的乳酸菌混合物及 其应用， 其特征在于， 所述的NLRP3信号通路mRNA表达为： 两歧双歧杆菌H3 ‑R2与乳酸乳球菌 KLDS4.032 5单独或联合均可不同程度降低AOM/DSS 小鼠结肠中NLRP3、 Caspase ‑1和IL‑1β 的 转录水平。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115011518 A 3