(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210734202.3 (22)申请日 2022.06.27 (66)本国优先权数据 202111535574.5 2021.12.15 CN (71)申请人 郑州大学第一附属医院 地址 450002 河南省郑州市二七区建 设东 路50号 (72)发明人 张岚　李文才　陈奎生　高冬玲　 姜国忠　李晟磊　张蕾　张延平　 温洪涛　刘恩杰　 (74)专利代理 机构 郑州市华翔专利代理事务所 (普通合伙) 41122 专利代理师 张爱军 (51)Int.Cl. G01N 21/64(2006.01)G01N 21/01(2006.01) (54)发明名称 一种非诊断目的用于荧光原位杂交检测中 精准定位乳腺浸润癌及微小 浸润癌的方法 (57)摘要 本发明提供一种非诊断目的用 于荧光原位 杂交检测 中精准定位乳腺浸润癌及微小浸润癌 的方法， 将免疫组织化学双染色检测及荧光原位 杂交检测共同应用在同一张切片上， 在同一张切 片上先进行免疫组织化学双染色， 然后进行荧光 原位杂交检测， 根据免疫组织化学Fastred显色 在荧光显微镜下有明亮的红色荧光， 而DAB显色 在荧光显微镜下没有荧光的特点， 在荧光原位杂 交检测片子上精准定位乳腺浸润癌或微小浸润 癌的位置 。 权利要求书2页 说明书6页 附图8页 CN 115112619 A 2022.09.27 CN 115112619 A 1.一种非诊断目的用于荧光原位杂交检测中精准定位乳腺浸润癌及微小浸润癌的方 法， 其特征在于， 在 同一张切片上先进行免疫组织化学双染色， 然后进行荧光原位杂交检 测， 根据免疫组织化学Fast  red显色在荧光显微镜下有明亮的红色荧光， 而DAB显色在荧光 显微镜下没有荧 光的特点， 精准定位乳腺浸润癌或微小浸润癌的位置 。 2.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述免疫组织化学双染色是将乳腺癌石蜡包 埋标本切片收在黏附性载玻片上， 使用辣根过氧化酶显色系统， 选用染色抗体E ‑Cadherin 进行DAB显色， 此时乳腺癌细胞浆被染为棕黄色； 使用碱性磷酸酶显色系统， 选用染色抗体 P63、 CK5/6进行Fast  red显色， 此时乳腺导管原位癌周围的肌上皮细胞被染为红色； 再用 HER‑2/CSP17双探针对上述切片进行荧 光原位杂交检测。 3.如权利要求1或2所述的方法， 其特 征在于， 免疫组织 化学双染色的操作步骤为： (1)将乳腺癌石蜡包埋标本切片收在黏附性载玻片上， 切片的厚度为 4 μm； (2)于65℃烤箱内烘烤切片1h； (3)使用全自动免疫组化染色系统进行免疫组织化学双染色， 染色抗体分别为： P63、 CK5/6、 E‑Cadherin。 4.如权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述全自动免疫组化染色系统的染色步骤 为： 1)烤片： 于75℃烤片4mi n； 2)脱蜡： 脱蜡试剂为Ventana  EZ Prep脱蜡液， 脱蜡温度75℃， 脱蜡时间20mi n； 3)抗原修复： 采用热修复方式， 抗原修复液为Ventana  CC1抗原修复缓冲液， 抗原修复 时间为52mi n， 温度为9 9℃； 4)孵育： 使用内源性过 氧化物酶抑制剂， 于 37℃下， 孵 育4min后， 进行清洗； 5)一抗孵育： 滴加E ‑Cadherin抗体100μL， 于37℃孵育28min后， 清洗去除未结合的一 抗； 6)二抗孵育： 滴加10 0 μL连有HRP的二 抗， 于37℃孵育8min后， 清洗去除未 结合的二 抗； 7)DAB显色： 滴加DAB试剂和H2O2试剂各10 0 μL， 于37℃显色8mi n后， 进行清洗， 终止 显色； 8)变性： 升温至94℃， 并维持4min， 对结合在组织上的一抗和二抗进行变性破坏， 防止 后续产生交叉反应； 9)第二次一抗孵育： 滴加抗体CK5/6和P63各100 μL， 于37℃孵育24min后， 清洗去除未结 合的一抗； 10)第二次二抗孵育： 先滴加100uL  Reaction buffer清洗缓冲液后， 再滴加100 μL连有 AP的二抗， 于37℃孵育12min后， 清洗去除未 结合的二 抗； 11)Fast red显色： 滴加Naphthol试剂和F ast red试剂各100 μL， 于37℃显色8min， 进行 清洗， 终止 显色； 12)复染： 滴加苏木素染液10 0 μL， 于37℃孵育12min后， 清洗去除未 结合的苏木素染料； 13)返蓝： 滴加返蓝液10 0 μL， 于37℃孵育4min后， 进行清洗 。 5.如权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述连有HRP的二抗为ULtraview  Universal   DAB试剂盒中的MuLtimer试剂； 所述连有AP的二抗为ULtraview  Universal  AP RED试剂盒 中的MuLtimer试剂。 6.如权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述内源性过氧化物酶抑制剂为ULtraview  权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115112619 A 2Universal  DAB试剂盒中的Inhibitor试剂； 所述DAB试剂和H2O2试剂来自ULtraview   Universal  DAB试剂盒； 所述N aphthol试剂和Fast  red试剂来自ULtraview  Universal  AP  RED试剂盒。 7.如权利要求4所述的方法， 其特征在于， 清洗时采用喷射式清洗方式， 使用pH7.5的 Tris‑HCl缓冲液进行清洗 。 8.如权利要求1 ‑3任一项所述的方法， 其特 征在于， 荧 光原位杂交检测的操作步骤为： (1)将进行过免疫组织化学双染色检测的切片放于荧光显微镜下观察， 若细胞间隙有 Fast red试剂的非特异性着色， 则将切片泡于37℃、 体积分数为75％酒精中35～40min， 去 除Fast red试剂的非特异性着色； 所述酒精溶 液中含有体积分数为0.1％的盐酸； (2)将切片浸泡于温度 为90℃的通透剂中5min； 所述通透剂来自人类HER ‑2基因扩增检 测试剂盒； (3)使用胃蛋白酶， 将切片于 37℃消化5～10mi n； (4)使用2 ×SSC缓冲液， 将切片于室温洗涤 2次， 每次5mi n； (5)将切片依次浸泡于体积分数为70％乙醇、 80％乙醇、 10 0％乙醇中， 各2mi n； (6)室温晾干切片； (7)向切片上滴加10μL  HER‑2/CEP17双探针， 加盖盖玻片， 使用封边胶封边； 所述HER ‑ 2/CEP17双探针来自人类H ER‑2基因扩增检测试剂盒； (8)将切片放入杂交仪内， 85℃变性5mi n， 42℃杂交16 h； (9)去除切片的封边胶， 揭掉盖玻片， 使用2 ×SSC缓冲液， 室温洗涤切片1mi n； (10)使用体积分数为0.3％NP ‑40/0.4×SSC溶液、 pH为7.0， 于 68℃洗涤切片2mi n； (11)使用去离 子水， 于37℃洗涤切片1mi n； (12)室温晾干切片， 滴加4,6 ‑联脒‑2‑苯基吲哚DAPI， 加盖 盖玻片； (13)使用荧 光显微镜观察切片， 进行精准定位。 9.如权利要求1或2所述的方法， 其特征在于， 所述精准定位的具体方法为： 首先在荧光 显微镜的明视场下找到细胞浆染为棕黄色的乳腺癌细胞， 然后关闭明视场光源， 打开暗视 野的汞灯； 若乳腺癌细胞团周围有明亮的红色荧光， 说明有肌上皮细胞的存在， 这团乳腺癌 细胞则为导管原位癌； 若乳腺癌细胞团周围没有明亮的红色荧光， 说明没有肌上皮细胞 的 存在， 这团乳腺癌细胞则为浸润癌或微小浸润癌。 10.如权利要求9所述的方法， 其特征在于， 精准定位乳腺浸润癌及微小浸润癌区， 观察 明确为浸润癌或微小浸润癌细胞核内荧光原 位杂交的信号点， 对信号点进 行计数得出检测 结果。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115112619 A 3