ICS 67.100.01 X 16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T3050—2016 羊奶真实性鉴定技术规程 Code of practice for adulteration in goat milk product 行业标准信息服务平台 2016-12-23发布 2017-04-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T3050—2016 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业部畜牧业司提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274）归口。 本标准起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、农业部奶产品质量安全风险评估实验室 （北京）、青岛农业大学、安徽农业大学、安徽省农业科学院畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人：郑楠、屈雪寅、杨晋辉、杨永新、胡菌、周雪巍、李松励、叶巧燕、于建国、文芳、许 晓敏、韩荣伟、张养东、程建波、王加启。 行业标准信息服务平台 I NY/T3050—2016 羊奶真实性鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了聚合酶链式反应（PCR)方法、二维凝胶电泳（2-DE)法及酶联免疫吸附（ELISA)法， 对生羊奶、超高温灭菌（UHT)液态羊奶和羊奶粉中掺人牛源性奶成分的定性检测方法。 本标准第一法和第二法适用于生羊奶、UHT灭菌液态羊奶及羊奶粉；第三法适用于生羊奶。 本标准第一法的检出限为：生羊奶中掺假2.0%生牛奶，生羊奶掺假0.2%牛奶粉，UHT液态羊奶 掺假5.0%UHT液态牛奶，羊奶粉掺假2.0%牛奶粉；第二法的检出限为生羊奶掺假5.0%生牛奶，生 羊奶掺假1.0%牛奶粉，UHT液态羊奶掺假5.0%UHT液态牛奶，羊奶粉掺假2.0%牛奶粉；第三法 的检出限为生羊奶掺假0.1%生牛奶。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 第一法聚合酶链式反应(PCR)法 3原理 提取奶及奶制品中体细胞DNA，利用牛特异性的引物通过PCR扩增牛特定的DNA序列，电泳分 离PCR产物，以牛源性成分PCR产物作对照，初步判断是否含有牛源性奶成分。通过对PCR扩增的 特定DNA片段进行测序，与标准序列进行比较，确认检测结果。 4试剂和材料 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，水应符合GB/T6682一级水的要求。 标准信息服务平台 4.1无水乙醇。 4.275%乙醇。 4.3三羟甲基氨基甲烷（Tris)。 4.4琼脂糖：电泳级。 4.5蛋白酶K：20g/L。 4.6核酸荧光染料。 4.7DNA分子量标记（Marker）：50bp~500bp。 4.8牛源性成分检测用引物（对）序列： 正向：5-GCCATATACTCTCCTTGGTGACA-3； 反向：5-GTAGGCTTGGGAATAGTACGA-3。 4.9磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液）：分别称取磷酸二氢钾0.27g、磷酸氢二钠1.42g、氯化钠8.0g、氯化 钾0.2g，于800mL水中充分溶解，用浓盐酸调节溶液pH至7.4，加水定容至1L，分装后高压灭菌。 4.10氯化钠溶液（0.9g/L)：称取0.90g氯化钠，于800mL水中充分溶解后，加水定容至1L。 4.11乳化缓冲液：取430mL浓度为0.9g/L的氯化钠溶液（4.10），加入10mL聚乙二醇对异辛基苯 1 NY/T3050—2016 基醚（TritonX-100）、60mL无水乙醇（4.1）混合均匀。 4.12三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris-HCI)溶液（1mol/L)：称取121.1gTris（4.3)于800mL水中充 分溶解。冷却至室温后，用盐酸调节溶液的pH至8.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。 4.13氢氧化钠溶液（10mol/L）：称取40.0g氢氧化钠，于80mL水中充分溶解后，加水定容至100 mL. 4.14EDTA溶液（0.5mol/L）：称取186.1g二水乙二胺四乙酸二钠，加人700mL水中，在磁力搅拌 器上剧烈搅拌，用10mol/L氢氧化钠溶液（4.13）调pH至8.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。 4.15溴代十六烷基三甲胺(CTAB)提取缓冲液：分别称取81.82g氯化钠、20.0g溴代十六烷基三甲 胺（CTAB），于800mL水中充分溶解后，加人100mLTris-HCI溶液（4.12）和40mLEDTA溶液 （4.14），加水定容至1L，分装后高压灭菌 氯甲烷）十V3（异戊醇）= SH 25+24+1。 RD 4.17Tris-EDTATE)缓冲液(PH为 10mLTris-HCI溶液（4.12） 和2mLEDTA溶液（4.14），加水定容 L分装后高压灭菌。 用灭菌水或TE缓冲液（4.17)将引物（4.8)稀释 umey 4.18引物溶液 到 4.192XTaqMix：内舍DNATag聚合酶0.05U/LMg B.0mmol 4mmol/L。 4.2050×TAE缓冲覆O称取Tris（43242.0g） 落解后，加人EDTA溶液 700ml天菌水中充 ，冰乙酸57 1ml充分溶解店加水定容至1 E (4.14)100mL TAE缓冲液：取10mL50×TAE缓冲液（4.20）加灭菌水定容至 4.210.5× 6×上样缓冲区： 4.22 内含EDTA30mmo1/ 溴酚蓝0.05%.丙 三醇36% 0.035%。 蓝 CH U 5仪器 5.1PCR扩增仪 5.2电泳仪。 5.3 凝胶成像仪 C 5.4 核酸蛋白分析 或紫 5.5离心机：转速不 高压灭菌锅 人 5.7 电子天平：感量 1mg和001 5.8恒温水浴锅：60℃可控 5.9pH计。 服务平台 5.10掌式离心机。 5.11磁力搅拌器。 5.12移液器：量程为10μL、200μL、1mL和5mL。 6分析步骤 6.1体细胞分离 15min，用1mLPBS缓冲液（4.9）将底部沉淀悬浮，转移于1.5mL离心管中，3000r/min离心10min， 弃去上清液。向离心管中加人1mLPBS缓冲液悬浮沉淀，1000r/min离心10min，弃去上清液。加入 150μL乳化缓冲液（4.11）及1mLPBS缓冲液悬浮沉淀，于40℃恒温水浴锅加热10min后， 2 NY/T3050—2016 3000r/min离心10min，弃去上清液。加人1mLPBS缓冲液洗涤沉淀，12000r/min离心10min，得到 体细胞。待测或一20℃冷冻保存。 6.2模板DNA提取及纯化 6.2.1CTAB法提取模板DNA及纯化 向上述得到的体细胞（6.1)中，加人800μLCTAB提取缓冲液（4.15），60μL蛋白酶K（4.5），60℃ 恒温水浴锅中加热2h，其间不时轻弹混匀。12000r/min离心10min，除去杂质。 缓颠倒混匀后，12000r/min离心15min。吸取上清液，置于另一支2mL离心管中，加人等体积的Tris 饱和苯酚、三氯甲烷和异戊醇混合液（4.16），12000r/min离心10min。将上清液转移于1.5mL离心 管中，加人两倍体积的无水乙醇溶液（4.1），混匀后于一20℃放置30min。12000r/min离心10min，弃 去上清液，加人1mL75%乙醇洗涤沉淀（4.2），12000r/min离心5min，弃去上清液。室温下挥发干残 留乙醇，加人30uL～50μLTE缓冲液（4.17）溶解DNA沉淀。可利用核酸蛋白分析仪或紫外分光光 度计测定提取DNA浓度及纯度（见附录A）。若蛋白残留量高，可向溶解的DNA中加人500μL灭菌 水和等体积的Tris饱和苯酚、三氯甲烷和异戊醇混合液（4.16）抽提，并重复之后操作步骤。得到的模 板DNA待测或置一20℃冻存。 同时，用不含牛源性的样品做阴性对照，用含有牛源性的样品做阳性对照。 6.2.2试剂盒提取模板DNA及纯化 可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA及纯化柱纯化DNA，按说明书操作。 6.3PCR扩增 在200μLPCR反应管中依次加人浓度为10umol/L正向和反向引物（4.18)各1μL，2XTaqMix 缓冲液10μL（4.19），模板DNA2μL～3μL，灭菌水补足体积至20μL。每个试样2个重复，同时进行 以灭菌水作为模板的空白对照。掌式离心机离心10s后，放入PCR仪中进行扩增。 PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，63℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃ 延伸7min，4℃保存。 6.4电泳检测PCR扩增产物 称取适量琼脂糖（4.4），加入0.5XTAE缓冲液（4.21）配制成2%的琼脂糖溶液，微波加热至完全 溶解，冷却至60℃左右，按每100mL琼脂糖溶液加入5μL核酸荧光染料（4.6）的比例，加入核酸荧光 染料。摇匀后倒人电泳板，放置合适的梳子，制成约5mm厚的凝胶，室温下遮光冷却至凝固。取下梳 子，放人含有0.5×TAE电泳缓冲液（4.21）的电泳槽中，液面高于凝胶2mm3mm。将5μL~8μL PCR扩增产物（6.3）与1μL6X上样缓冲液（4.22）混合后，加人点样孔中。同时，加人5μLDNA分子 量标记（4.7）于每个点样孔中。5V/cm~8V/cm恒压电泳，时间20min~30min。结束后，将凝胶取出 置于凝胶成像仪进行成像，根据DNA分子量标记判断目的条带大小。 7结果分析及表述 7.1当阴性对照和（或）空白对照在271bp处出现条带，而阳性对照