ICS 67.080.01 CCS B 30 中华人民共和国国家标准 GB/T 40833—2021 甘蔗皮渣中对香豆酸检测方法 高效液相色谱法 Determination of p-coumaric acid in sugarcane rinds- High performance liquid chromatography 2022-05-01实施 2021-10-11发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T40833—2021 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任， 本文件由中国标准化研究院提出并归口。 本文件起草单位：北京化工大学、深圳市标准技术研究院、北京电子科技职业学院、中国标准化研究 院、食药环检验研究院（山东）集团有限公司、中国农业大学、大连依利特分析仪器有限公司、天津阿尔塔 科技有限公司、华测检测认证集团股份有限公司、中山内得农业科技有限公司、捷科思农业科技（徐州） 有限公司。 本文件主要起草人：魏芸、席兴军、杨志花、兰韬、倪汉文、孙学文、车芬芳、唐涛、辛秀兰、赵新颖、 张腾、谢军、刘涛、张磊、刘聪、孙宇、刘瑾玲、徐银、施珊玲。 1 GB/T408332021 甘蔗皮渣中对香豆酸检测方法 高效液相色谱法 1范围 本文件描述了甘蔗皮渣中对香豆酸含量的高效液相色谱测定方法。 本文件适用于甘蔗皮渣中对香豆酸的定性定量测定。对含有对香豆酸产品的含量检测可参照 使用。 本文件检出限为26.8mg/g，定量限为89.2mg/g 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度） 第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4原理 甘蔗皮渣试样用2mol/LNaOH溶液提取，6mol/L的HCI溶液调节pH至2.0左右，乙酸乙酯萃 取后经C18色谱柱分离，紫外-可见光检测器检测，色谱峰保留时间定性，外标法定量。 5试剂和材料 5.1试剂 除非另有说明，所有试剂均为色谱纯，水为GB/T6682规定的一级水。 5.1.1甲醇（色谱纯）。 5.1.2 乙酸（色谱纯）。 5.1.3 乙酸乙酯（色谱纯）。 5.1.4盐酸（优级纯36%~38%）。 5.1.5 氢氧化钠（分析纯）。 5.2 试剂配制 乙酸水溶液（0.1%）：移取0.25mL乙酸（5.1.2）于250mL容量瓶中，用水定容至刻度。 1 GB/T40833—2021 5.3标准品 对香豆酸标准品（C，H.O：，CAS号：501-98-4）：纯度大于98.0%。 5.4标准溶液配制 5.4.1对香豆酸标准储备溶液（1.0mg/mL）：准确称取对香豆酸标准品25.0mg（精确至0.1mg）于 25mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成浓度为1.0mg/mL的标准储备液。放置于4℃冰 箱避光保存，有效期为一个月。 5.4.2对香豆酸系列标准工作液：准确移取对香豆酸标准储备液（5.4.1)40uL、0.20mL、0.80mL、 1.00mL、4.00mL、8.00mL、10.00mL至10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。该标准系列浓度分别 为4.0μg/mL、20.0μg/mL.80.0μg/mL.100μg/mL.400μg/mL,800μg/mL、1000μg/mL。临用时 配制。 6仪器和设备 6.1高效液相色谱仪，配有紫外-可见光检测器或二极管阵列检测器。 6.2天平：感量为0.0001g和0.001g。 6.3烘箱。 6.4磁力搅拌器。 6.5抽滤装置。 6.6 pH计。 6.7离心机。 6.80.45μm微孔水相滤膜 6.9 90.45um针筒式有机相及水相过滤器。 7检测步骤 7.1试样制备 7.1.1甘蔗皮渣粉末，置于80℃烘箱中烘干2h，保存待用。 7.1.2称取0.200g（精确至0.001g）甘蔗皮渣粉末样品与梭形转子放于25mL烧瓶中，移取10mL 2mol/L氢氧化钠溶液，轻轻摇晃使样品和溶剂混合均匀，调节磁力搅拌器使转子能够带动溶液在室温 下搅拌6h 7.1.3取下烧瓶将溶液倒人放置两层中速定量滤纸的抽滤装置中，过滤，移取5mL2mol/L氢氧化钠 溶液分3次加入烧瓶中冲洗内壁，洗液全部倒入抽滤装置中，摇匀。 7.1.4将滤液倒入100mL烧杯中，用少量2mL纯水清洗抽滤瓶，洗液并入烧杯中。移取4.0mL 6mol/L盐酸溶液充分摇匀后再逐滴加人6mol/L盐酸溶液，调节pH至2.0左右，用1mL纯水冲洗 pH计电极，洗液倒人烧杯中。 7.1.5将上述酸性溶液转人25mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀后以8000r/min的转速离心 5min，取部分溶液用0.45um针筒式水相过滤器过滤，即为试样液，待测。 7.2色谱测定 7.2.1参考色谱条件 色谱柱：Cls柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5um，或具有同等性能的色谱柱。 2 GB/T 40833—2021 流动相：A为甲醇,B为0.1%乙酸溶液。 流速：1.0mL/min。 柱温：30℃。 测定波长：254nm。 进样体积：10μL。 梯度洗脱条件见表1。 表1液相色谱梯度洗脱条件 时间/min A/% B/ % 0.00 30 70 30.00 80 20 30.01 30 70 35.00 30 70 7.2.2 标准曲线的绘制 的浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线（对香豆酸标准色谱图见附录A中图A.1）。 7.2.3试样测定 将试样液注人高效液相色谱仪中，以保留时间定性，同时记录其峰面积，根据标准曲线计算出试样 液中对香豆酸的浓度，平行测定次数不少于3次。待测试样中对香豆酸的响应值应在标准曲线线性范 围内，超过线性范围则应稀释后再进行分析。甘蔗皮渣粗提物色谱图见附录A中图A.2。 7.2.4空白实验 除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。 8 分析结果的表述 试样中对香豆酸的含量由色谱数据处理软件或按式(1)计算： (1) X1000 式中： X 试样中对香豆酸的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； 试样液中对香豆酸的质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； V 被测试样的总体积，单位为毫升（mL）； m 称取试样的质量，单位为克（g）； 1000 换算系数。 计算结果以重复性条件下获得的3次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。 ９精密度 9.1 “一般规定 本文件的精密度按照GB/T6379.2的规定确定，重复性和再现性的值以95%的可信度来计算。 3