ICS 65.020.01 CCS B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 40627—2021 油菜茎基溃疡病菌活性检测方法 Viability test of Leptosphaeria maculans (Desm) Ces. et De Not. 2021-10-11发布 2022-05-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T40627—2021 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 本文件由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国深圳海关、深圳市检验检疫科学研究院。 本文件主要起草人：高瑞芳、章桂明、王颖、黄河清、向才玉、李娜。 GB/T406272021 油菜茎基溃疡病菌活性检测方法 1范围 本文件描述了应用普通荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜对油菜茎基溃疡病菌LLeptosphaeric maculans（Desm.）Ces.etDeNot.J分生孢子进行活性检测的方法 本文件适用于油菜茎基溃疡病菌相关寄主中携带的油菜茎基溃疡病菌分生抱子的活性检测鉴定。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4原理 应用荧光染料对油菜茎基溃疡病菌分生孢子进行染色处理，根据碘化丙啶（PropidiumIodide，PI) 能够穿透正在死亡或者已经死亡的细胞膜，不能透过具有活力的细胞膜，使不具活性的孢子发出红色荧 光、具有活性的孢子不发出荧光的特点，运用普通荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜对荧光染料处理 的分生孢子进行检测，分析其活性情况。油菜茎基溃疡病菌基本信息见附录A。 5 仪器和试剂 5.1试剂 碘化丙啶（PI)溶液配置方法：称取0.01gPI粉末，加入10mL无菌水，配制成浓度为1mg/mL的 母液，置于棕色瓶4℃避光保存，使用前配制所需浓度 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：200g去皮土豆切成小方块，加人1000mL自来水，煮沸 1000mL，分装到三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20min。 5.2设备 激光扫描共聚焦显微镜或普通荧光显微镜、高压灭菌锅、生物安全柜、生化培养箱、冰箱、离心机。 6活性检测方法 6.1检测样品制备 在超净工作台中，用解剖针将油菜茎基溃疡病菌分生孢子挑到灭菌水中，充分振荡3min，在显微 1 GB/T40627—2021 镜下检测样品浓度，确定稀释比例，配制成终浓度为10个孢子/μL～100个孢子/μL的孢子悬浮液，镜 检，备用。 6.2孢子染色 取199μL孢子悬浮液，加入1μL质量浓度为0.1mg/mL的PI染料，混匀，室温下避光染色 4min，染色完成后，16000g离心1min去上清液终止染色，加入灭菌去离子水洗涤一次，重新悬浮。 避光放置备用。 6.3普通荧光显微镜检测 6.3.1制片 吸取5L活性染料处理之后的样品制备玻片，封片，放置于普通荧光显微镜载物台上，低倍镜下找 到孢子，转到100倍油镜下观察，微调至视野内图像清晰。 6.3.2检测 至少检测30个抱子，观察染色情况。 PI染色检测：将荧光光路打开，设置荧光通道的激发波长534nm，收集荧光信号的发射波长617nm， 收集荧光信号。微调至视野内图像清晰。染色结果参见附录B。 为了保证图像能够反映出孢子最真实的荧光染色情况，首先需要确认明场通道下所得到孢子符合 油菜茎基溃疡病菌分生孢抱子形态特征，且图像清晰 6.4激光扫描共聚焦显微镜检测 6.4.1制片 吸取5uL活性染料处理之后的样品制备玻片，封片，置于激光扫描共聚焦显微镜载物台上，低倍镜 下找到抱子，转到100倍油镜下观察，微调至视野内图像清晰。 6.4.2激光设置 选择相应的激光管（氩离子激光器）激发荧光信号，PI检测设置荧光通道的激发波长（534nm），收 集荧光信号的发射波长（617nm），并设置一个明场通道作为对照。 6.4.3扫描设置 选择低像素扫描模式扫描（xy：512×512），重复扫描次数Average为1次，扫描速度Speed为9，根 至质量较好的效果。再用精确扫描方式（xy：2048X2048）根据信噪比调整扫描模式，选择精确像素的 平面扫描方式进行粗略扫描（xy：2048×2048），重复扫描次数Average为2次，扫描速度Speed为6， 获取最终图像。 6.4.4检测 扫描至少30个抱子，观察染色结果。 为了保证图像能够反映出抱子最真实的荧光染色情况，首先需要确认明场通道下所得到抱子符合 油菜茎基溃疡病菌分生孢子形态特征，且图像清晰 6.5萌发试验 取孢子悬浮液100μL，均匀涂布于PDA培养基上，用封口膜封口，置于25℃培养9h以上，观察孢 2 GB/T406272021 子萌发情况，以芽管长度大于孢子本身长度视为萌发。 结果判断与表述 结果判断与表述如下： 孢子中，所有孢子均无红色荧光，判定油菜茎基溃疡病菌孢子具有活性，参见附录B； 孢子染色后通过普通荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜随机扫描至少30个孢子，所扫描的 孢子中，所有抱子均呈红色荧光，判定油菜茎基溃疡病菌孢子不具活性，参见附录B； 激光扫描共聚焦显微镜或普通荧光显微镜扫描结果，存在少数分生孢抱子或个别分生孢子具有 很弱的荧光，而无法判断孢子活性的，则对未染色的孢子进行萌发实验，根据萌发情况判定，如 萌发则判定具有活性，如不萌发则判定不具有活性 3样品与原始数据保存 8 8.1 样品保存 存查样品应在4℃条件下妥善保存6个月。如发现具有活性的油菜茎基溃疡病菌孢子的，该样品 应保存1年，以备复验，如涉及贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕。保存期满后，需经灭菌处理 8.2 2原始数据保存 样品检测结束后，其原始记录单和检验结果或证书应归档，妥善保管，以备复验、谈判和仲裁。 3