ICS 07.080 CCS A 40 中华人民共和国国家标准 GB/T 40179—2021 植物中有机酸的测定 液相色谱-质谱/质谱法 Determination of organic acids in plant- Liquid chromatography-tandem mass spectrometry 2021-05-21发布 2021-12-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T 40179—2021 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387)提出并归口。 本文件起草单位：中国测试技术研究院生物研究所、四川大学、中国计量大学、北京工商大学、河北 省食品检验研究院 本文件主要起草人：李怀平、冯德建、宋航、吴微、许洋、邹燕、叶善蓉、周李华、叶子弘、马爱进、张岩。 SZG 1 GB/T 40179—2021 植物中有机酸的测定 液相色谱-质谱/质谱法 1范围 本文件规定了植物中有机酸的液相色谱-质谱/质谱测定方法。 本文件适用于柑橘、苹果、草莓、黄瓜、西红柿、金银花、党参、山楂、枸杞中富马酸、反式-乌头酸、 已二酸、没食子酸、香草酸、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸、对羟基苯甲酸、水杨酸、2，5-二羟 基苯甲酸和3，4-二羟基苯甲酸的测定 2规范性引用文件 2 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 有机酸 organicacids 植物材料中一类具有酸性的有机化合物。 4原理 试样用50%甲醇溶液加热回流提取后，经反相色谱柱分离，液相色谱-质谱/质谱法测定和确证，内 标工作曲线法定量。 试剂或材料 5 除非另有说明，本方法使用的试剂均为色谱纯。水为GB/T6682规定的一级水。 5.1甲醇。 5.2甲酸。 5.30.1%甲酸溶液：移取甲酸1.0mL于1L容量瓶中，用水定容至刻度 5.450%甲醇溶液：移取甲醇500.0mL于1L容量瓶中，用水定容至刻度。 5.5有机酸标准品：富马酸、反式-乌头酸、已二酸、没食子酸、香草酸、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、对香豆 酸、阿魏酸、对羟基苯甲酸、水杨酸、2，5-二羟基苯甲酸、3，4-二羟基苯甲酸和琥珀酸-2，2，3，3-d，，化合物 信息详见附录A中表A.1，纯度均98%。 5.6单一标准储备液：分别准确称取各有机酸标准品适量（精确到0.01mg），其中富马酸、反式-乌头酸 1 GB/T40179—2021 和没食子酸用水溶解，已二酸、香草酸、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸、对羟基苯甲酸、水杨 单一标准储备液，于0℃～4℃下密封保存，有效期为3个月。 5.7混合标准储备液：分别准确吸取适量各有机酸单一标准储备液于同一10mL容量瓶中，用50%甲 保存，有效期为3个月 匀，配制成浓度为100mg/L的内标储备液，于0℃～4℃下密封保存，有效期为3个月 5.9内标溶液：准确吸取内标储备液1.0mL于100mL容量瓶中，用50%甲醇溶液稀释并定容至刻 度，混匀，配制成浓度为1.0mg/L的内标溶液，现配现用。 2.5mL内标溶液，用50%甲醇溶液稀释配制成浓度均为0.10mg/L、0.25mg/L、0.50mg/L、0.75、 1.0mg/L、1.25mg/L的系列混合标准工作溶液，现配现用。 5.110.22um亲水性尼龙微孔滤膜 6仪器设备 6.1 液相色谱-质谱/质谱联用仪：配电喷雾离子源（ESI）。 6.2电子天平：感量为0.0001g和0.01mg。 6.3高速离心机：转速不低于10000r/min。 6.4高速均质器。 6.5高速粉碎机。 6.6冷凝回流装置。 7分析步骤 7.1样品制备 取金银花、党参、山楂、枸杞等有代表性干制样品约1kg，用粉碎机粉碎，混匀，制备好的试样均分 成两份，装人洁净的盛样容器内，密封并标识，于0℃～4℃下避光保存，一周内测定 取柑橘、苹果、草莓、黄瓜、西红柿等有代表性新鲜样品约1kg，用均质器制成匀浆，制备好的试样 均分成两份，装人洁净的盛样容器内，密封并标识，现制现用。 7.2试样处理 称取约1.5g干样或10g鲜样（精确至0.001g）于100mL圆底烧瓶中，加入内标储备液625uL和 50%甲醇溶液30mL，加热回流2.5h，趁热过滤，滤液转人50mL容量瓶中，用15mL50%甲醇溶液分三 次洗涤圆底烧瓶和样品残渣，洗液合并入容量瓶中，用50%甲醇溶液定容至刻度，混匀，于10000r/min下 离心5min，取2.0mL上清液于10mL容量瓶中，用50%甲醇溶液定容至刻度，混匀，过0.22μm尼龙 滤膜，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。 7.31 仪器参考条件 7.3.1液相色谱参考条件 a）色 色谱柱：HSST3柱，2.1mm×150mm，粒径1.8μm，或同等性能的色谱柱； 2 GB/T 40179—2021 b） 流动相：流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱程序见表1； c) 流速：0.2mL/min; (P 柱温：30℃； e) 进样量：1μL。 表1流动相梯度洗脱程序 时间/min 流动相A体积分数/% 流动相B体积分数/% 0 95 5 6 6 5 15 40 60 20 5 95 25 5 95 25.1 95 5 35 95 5 7.3.2 质谱参考条件 a) 离子源：电喷雾离子源（ESI）； b) 扫描方式：负离子模式； c) 检测方式：多反应监测（MRM)； (p 干燥气、雾化气、碰撞气均为高纯氮气；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要 求，参考条件参见附录B； e） 喷雾电压、源内碎裂电压、碰撞气能量等参数应优化至最佳灵敏度，参考条件参见附录B。 7.4 液相色谱-质谱/质谱测定 7.4.1定性测定 在相同实验条件下进行样品测定时，如果样品中待测物质的保留时间和标准工作溶液中对应的保 留时间一致（变化范围在士2.5%以内），且样品谱图中待测组分监测离子的相对丰度和浓度相当的标准 品的相对丰度一致，允许偏差不超过表2规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。 表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度/% >50 >20~50 >10~20 o1> 允许的相对偏差/% ±20 ±25 ±30 ±50 7.4.2定量测定 在相同实验条件下，将有机酸系列混合标准工作溶液由低到高浓度依次进样分析，以被测物和内标 物的定量离子峰面积之比为纵坐标，以被测物的浓度为横坐标，绘制内标标准工作曲线，用内标标准工 作曲线对样品进行定量，应使样品溶液中各被测物的响应值在仪器测定的线性范围内，如果含量超过内 标标准工作曲线范围上限，应适当减少取样量后重新测定。在上述条件下，各有机酸的参考保留时间参 见附录B中表B.1,多反应监测图参见附录C。 3