ICS 11.220 B 41 GP 中华人民共和国国家标准 GB/T 22333—2008 日本乙型脑炎病毒 反转录聚合酶链反应试验方法 Reverse transcription polymerase chain reaction for Japanese B encephalitis virus 2008-08-22发布 2008-12-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22333—2008 前言 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：农业部兽医诊断中心。 本标准主要起草人：王宏伟、孙明、王传彬、陈西钊、田克恭 GB/T22333—2008 日本乙型脑炎病毒 反转录聚合酶链反应试验方法 1范围 本标准规定了日本乙型脑炎病毒核酸的反转录聚合酶链反应试验的技术要求 本标准适用于动物脑组织中日本乙型脑炎病毒核酸的检测。 2试剂 2.1变性液（见第A.1章）。 2.22mol/L乙酸钠溶液（pH4.0）。 2.3酚-三氯甲烷-异戊醇混合液（见第A.2章）。 2.4 2. 5 mmol/L dNTP。 2. 5 8mmol/L上下游引物混合液（引物序列见第A.3章）。 2. 6 510倍PCR缓冲液。 2.7 1%溴化乙锭（EB）溶液。 2. 8 3TAE电泳缓冲液。 2.91%琼脂糖凝胶 2. 10 上样缓冲液（见第A.4章）。 5U/μLTaqDNA聚合酶、异丙醇、75%乙醇溶液、25mmol/L氯化镁溶液、DEPC处理过的无菌双 蒸水。 3实验室条件 3.1实验室级别要求 实验室必须为生物安全Ⅲ级（BSL-3级）实验室。 3.2实验室分区 RT-PCR试验区域分反应液配制区（配液区）、核酸提取区、扩增区、电泳区。流程顺序为配液区→ 核酸提取区→扩增区→电泳区。严禁器材和试剂倒流。 3.3实验室应配备的仪器及耗材 3.3.1仪器：分析天平、高速离心机、真空干燥器、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫 别为2 μL、20μL、200μL、1000 μL)。 管、琼脂糖、500mL量筒、500mL锥形瓶、吸头（10uL、200uL、1000μL）、灭菌双蒸水 4操作程序 4.1样品的采集及处理 4.1.1样品的采集：濒死动物、扑杀动物或流产胎儿取脑组织。 4.1.2样品的处理：每份样品分别处理。 1 GB/T223332008 4.1.2.1组织样品处理：取待检脑组织病料约0.05g置研磨器中剪碎并研磨，加入400μL变性液继 续研磨。取已研磨好的待检病料上清200μL，置1.5mL灭菌离心管中，加人200μL变性液，混匀。 4.1.2.2阳性对照处理：取日本乙型脑炎病毒弱毒疫苗200μL，置1.5mL灭菌离心管中，加人200μL 变性液，混匀。 4.1.2.3阴性对照处理：取健康猪血清200μL，置1.5mL灭菌离心管中，加人200μL变性液，混匀。 4.2病毒RNA的提取 4.2.1取已处理的待检样品及阴性、阳性对照样品，每管依次加人乙酸钠溶液30uL、酚-三氯甲烷-异 4.2.2取上清300μL置于新的经DEPC水处理过的1.5mL灭菌离心管中，加人等体积异丙醇，混 向放人离心机内，4℃20000g离心20min 掉，将离心管倒扣于吸水纸上1min，真空抽干15min。 4.2.4用10uL无RNA酶的灭菌双蒸水和1uLRNA酶抑制剂沿离心管开口侧相反方向溶解沉淀。 一20℃储存备用。 4.3RT-PCR反应液组成（总体积25μL） DEPC水 13. 8 μL 2. 5 mmol/L dNTP 2.5 μL 8mmol/L上下游引物混合液 1. 5 μL 25mmol/L氯化镁溶液 1. 2 μL 10倍PCR缓冲液 2.5 μL AMV反转录酶 0.2 μL RNA酶抑制剂 0.3 μL 5U/μLTaqDNA聚合酶 1 μL 提取的RNA 2 μL 4.4RT-PCR反应程序 10 min。 4.5电泳 点样孔加入100bpDNA分子质量标准物，以5V/cm电压电泳40min，用紫外凝胶成像仪观察结果。 5结果判定 当阳性对照出现375bp扩增带，阴性对照未出现目的带时，实验结果成立。被检样品出现375bp 扩增带为日本乙型脑炎病毒阳性，未出现相应扩增带的样品判为阴性。 2 GB/T22333—2008 附 （规范性附录） 试剂的配制 A.1变性液 柠檬酸钠 0.764 g 十二烷基肌氨酸钠 0.5 g β-巯基乙醇 0.868 mL 异硫氰酸胍 7.418 g 灭菌双蒸水 加至100mL A. 2 2酚-三氯甲烷-异戊醇混合液 酸性酚 50mL 三氯甲烷 49mL 异戊醇 1 mL A. 3 引物序列 上游引物P5'-CATTCCAAGCGAAGCAGGAGATCC-3 下游引物 P²5'-GAC GTC CAA TGT TGG TTT GTC G-3 A.4上样缓冲液 溴酚蓝0.2g，加双蒸水10mL过夜溶解。50g蔗糖加人50mL水溶解后，移入已溶解的溴酚蓝溶 液中，摇匀定容至100mL。